养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏的氧化应激水平及病理改变的影响

杨晓晖 李淑贞 宋翠荣 崔茂香 梁金环

1.沧州医学高等专科学校科研处，河北沧州061001；2.沧州医学高等专科学校基础部，河北沧州061001；3.沧州医学高等专科学校口腔系，河北沧州061001

养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏的氧化应激水平及病理改变的影响

杨晓晖1李淑贞2宋翠荣3崔茂香2梁金环2

1.沧州医学高等专科学校科研处，河北沧州061001；2.沧州医学高等专科学校基础部，河北沧州061001；3.沧州医学高等专科学校口腔系，河北沧州061001

目的探讨养阴活血方药对糖尿病大鼠肝脏氧化应激水平及病理改变的影响。方法采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）造糖尿病大鼠模型，挑选造模成功的大鼠，随机分为四组：糖尿病模型组；中药6周组，中药8周组，中药10周组，另外随机选出8只作为正常对照组，造模成功后分别于6、8、10周取材，测定肝组织氧化指标并进行病理观察。结果与正常对照组比较，糖尿病模型组的丙二醛（MDA）的含量明显增加（P＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性明显降低（P＜0.01）。与糖尿病模型组相比，中药干预组各阶段MDA的含量明显减少（P＜0.05或P＜0.01），中药8周组和中药10周组SOD活性和GSH-Px活性均有显著升高（P＜0.05或P＜0.01），中药6周组虽有升高SOD活性和GSH-Px活性的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。病理学观察，模型组肝细胞索及肝小叶结构紊乱，炎症细胞增多，说明肝组织有损伤。与模型组比较，中药干预组各阶段形态学改变均有改善。结论养阴活血方药具有一定的抗氧化能力，抑制氧化应激，对糖尿病大鼠肝脏具有一定的保护作用。

糖尿病；大鼠；肝脏；氧化应激；养阴活血方药

糖尿病是常见的内分泌代谢疾病之一，发病率逐年增加，严重威胁人类的健康。糖尿病肝脏性疾病是糖尿病并发症之一。有资料表明糖尿病2型患者非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化的风险增加[1]；2型糖尿病罹患癌症风险增加，对糖尿病患者的处置中应该附加癌症筛查[2]。糖尿病肝病的病因及发病机制仍未完全明了，许多研究者认为，除遗传、环境和自身免疫等因素外，氧化应激可能也与其发生、发展及转归有密切关系[3-4]，而且目前中药防治糖尿病肝脏性疾病的研究较少，本研究建立糖尿病大鼠模型，采用养阴活血方药进行治疗，观察糖尿病对大鼠肝脏氧化应激的损伤作用以及在不同时期养阴活血方药的治疗效果，探讨其保护肝脏的机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器

4个月龄健康雄性SD大鼠，清洁级，体重为250～300 g，购自河北省实验动物中心（动物合格证编号：809091）。链脲佐菌素（STZ，Sigma公司），丙二醛测定试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其余试剂均为国产分析纯。血糖检测仪（购于强生公司），7200型可见分光光度计（上海尤尼柯公司），德国莱卡荧光倒置显微镜。

1.2 中药配方

养阴活血方药组成：熟地20 g、山药15 g、牡丹皮20 g、山茱萸10 g等六味中药。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立及分组处理，SD大鼠适应性饲养1周，随机选出8只作为正常对照组，其他大鼠禁食不禁水12 h，称质量，腹腔注射STZ造糖尿病模型，72 h后测空腹血糖（FPG），以连续3 d的FPG≥11.1mmol/L，并且有多食、多饮，多尿症状者，为模型成功标准。挑选造模成功的大鼠，随机分为四组，每组各8只，包括：糖尿病模型组；中药6周组，中药8周组，中药10周组。各组正常饲料喂养，对照组和糖尿病模型组自由饮水，中药干预组按人与动物间体表面积折算的等效剂量比值灌喂给药。造模成功后分别于6、8、10周取材，用10%水合氯醛麻醉大鼠，股动脉放血，并取肝脏，部分固定，其余放入液氮，-70℃保存备用。

1.3.2 氧化应激指标测定，取肝组织1 g左右，称重，加入9倍体积匀浆介质，于冰浴中制备10%组织匀浆，4℃3500 r/min离心10 min，取上清。用化学比色法测定肝匀浆丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 病理观察取适量肝组织，切成2～3 mm厚的薄片，用4%多聚甲醛固定，24 h后酒精梯度脱水、透明，浸蜡，常规石蜡包埋，制备切片，去蜡后进行HE染色，在显微镜下观察肝组织形态学变化并拍片。

1.4 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，两独立样本的计量资料采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织氧化指标变化

与正常对照组比较，糖尿病模型组的MDA的含量明显增加（P＜0.01），SOD活性、GSH-Px活性明显降低（P＜0.01）。与糖尿病模型组相比，中药干预组各阶段MDA的含量明显减少（P＜0.05或P＜0.01），中药8周组和中药10周组SOD活性和GSH-Px活性均有显著升高（P＜0.05或P＜0.01），中药6周组虽有升高SOD活性和GSH-Px活性的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与中药6周组比较，中药8周组和中药10周组MDA的含量明显减少（P＜0.05），SOD活性均有显著升高（P＜0.05），中药10周组GSH-Px活性显著升高（P＜0.01），与中药8周组比较，中药10周组MDA的含量减少，SOD活性升高，但差异无统计学也意义（P＞0.05），中药10周组GSH-Px活性显著升高（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠肝组织氧化指标变化（±s，n=8）

表1 各组大鼠肝组织氧化指标变化（±s，n=8）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.01；与糖尿病模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与中药6周组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与中药10周组比较，#P＜0.01；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶

组别MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）正常对照组糖尿病模型组中药6周组中药8周组中药10周组0.43±0.07 0.61±0.09▲0.51±0.01*0.47±0.04**Δ0.45±0.06**Δ196.56±27.70 132.46±13.46▲146.50±10.92 155.89±18.81*Δ165.58±12.76**Δ298.22±33.70 194.86±20.79▲210.60±16.96 224.56±13.17*#246.60±10.23**ΔΔ

2.2 大鼠肝组织形态学变化

正常对照组肝小叶结构清晰，肝细胞索和肝窦排列规则；糖尿病模型组肝细胞索及肝小叶结构紊乱，炎症细胞增多，说明肝组织有损伤。与糖尿病模型组比较，中药干预组各阶段形态学改变均有改善。见图1。

3 讨论

糖尿病可造成糖脂代谢紊乱，肝脏作为糖脂代谢重要的靶器官，糖尿病状态下可产生脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病，其机制可能与氧化应激有关[5]。氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加和（或）消除能力降低，导致活性氧（ROS）家族在机体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤。肝脏是外源性过氧化物在体内转化和排泄的主要场所，当肝脏内促氧化物和抗氧化物之间的动态平衡严重失调时，即可导致氧化应激，产生大量自由基，后者可导致肝细胞大小膜泡的形成；膜通透性、流动性丧失；DNA损伤及诱发细胞凋亡，造成肝损伤[6]。同时氧自由基也可以促进肝星状细胞的增殖和胶原的合成，促进肝纤维化形成[7]。

研究表明，2型糖尿病患者遭受着长期的氧化应激，氧化应激是糖尿病合并症的一种致病因子[8]。

目前MDA的含量（组织中脂质过氧化程度的一项指标）和SOD、GSH-Px活性（体内抗氧化防御体系中消除ROS的重要抗氧酶）常被用作反映组织细胞氧化应激的指标。MDA是反映脂质过氧化程度的指标，也间接反映了机体细胞受自由基攻击的程度[9]。SOD是抗氧化体系中最为关键的酶，机体对氧自由基的灭活主要由SOD完成，测定其活力可间接反映氧自由基产生的情况[10]。超氧阴离子（O2-）由SOD催化O2-转化为过氧化氢（H2O2），H2O2可由GSH-Px催化生成水的同时，氧化还原型的谷胱甘肽，GSH-Px也可以清除MDA。本实验中，糖尿病模型组大鼠肝组织的MDA的含量明显增加，SOD活性、GSH-Px活性明显降低，说明机体氧化应激水平增高，导致肝损伤，研究表明，MDA可激活NADPH氧化酶产生更多的ROS，进一步损伤肝细胞[11]。HE染色显示模型组肝细胞索及肝小叶结构紊乱，炎症细胞增多，也说明肝组织有损伤。

图1 大鼠肝组织形态学变化（HE，200×）

糖尿病属于中医学中“消渴”兼“胁痛”等范畴，有资料表明，中药可以治疗糖尿病并发症[12]，而且中药还可以缓解糖尿病大鼠的氧化应激，增强机体抗氧化能力[13-14]，中药治疗糖尿病大鼠，可以使SOD的活性及谷胱甘肽含量显著增加；活性氧族ROS、MDA等降低[15]，还可以增加GSH-Px和过氧化氢酶（CAT）的活性[16]。本实验所用养阴活血方药是经多年研究和临床试验的核心方剂[17]，由熟地、山药、牡丹皮、山茱萸等六味中药组成。该方药不仅具有降糖作用，而且牡丹皮、熟地、山药、山茱萸中的某些成分如多糖类、丹皮酚、环烯醚萜总苷等又具有一定的抗氧化作用。实验结果表明各阶段养阴活血方药均可不同程度地提高糖尿病大鼠肝组织SOD活性和GSH-Px活性，减少MDA的含量，中药6周组虽有升高SOD活性和GSH-Px活性的趋势，但没有统计学差异，说明该阶段效果较差，随着治疗进程，中药8周组已经有显著的效果，中药10周组效果最为明显，说明相对来说治疗时间长一些效果较好。HE染色显示中药干预组各阶段形态学改变均有改善，同样是中药干预10周后效果最佳。

综上所述，该方药可减少自由基产生，抑制氧化应激，对糖尿病大鼠肝脏具有一定的保护作用，随着治疗进程，效果越来越好，其在糖尿病的临床治疗中可进一步推广。

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Effects of Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe on oxidative stress level and pathologic changes in diabetic rat liver

YANG Xiaohui1LIShuzhen2SONG Cuirong3CUIMaoxiang2LIANG Jinhuan2
1.Scientific Research Department,Cangzhou Medical College,Hebei Province,Cangzhou 061001,China;2.Foundation Department,Cangzhou Medical College,Hebei Province,Cangzhou 061001,China;3.Cavitas Oris Department, Cangzhou Medical College,Hebei Province,Cangzhou 061001,China

Objective To discuss the effects of Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe on oxidative stress level and pathologic changes in diabetic rat liver.M ethods Diabetic ratswere induced by intraperitoneal streptozotocin (STZ)injection.Successfully-established model rats were selected and randomly divided into four groups:diabetic group,traditional Chinesemedicine(TCM)six-week intervention group,TCM eight-week intervention group,TCM tenweek intervention group.In addition,eight normal rats were randomly chosen as normal control group.Rat livers were extracted respectively after six weeks,eightweeks and ten weeks to determine oxidation index and undertake pathologic observation.Results Compared with normal control group,contents ofmalonaldehyde(MDA)in rat livers of diabetic group rose significantly(P＜0.01),activities of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)were notably lower than those of normal control group(P＜0.01);compared with diabetic group,contents of MDA in rat livers of TCM intervention group in each period decreased strikingly(P＜0.05 or P＜0.01),activitiesof SOD and GSH-Px in TCM eight-week intervention group and TRC ten-week intervention group increased significantly(P＜0.05 or P＜0.01). Rising tendency was shown from activities of SOD and GSH-Px in TCM six-week intervention group,but there was no statistics difference(P＞0.05).By pathology observation,liver cell cords and hepatic lobules structure of diabetic group were chaotic,with inflammatory cells increasing,which indicated that there were injuries in hepatic tissue.Compared with diabetic group,morphology changeswere improved in every phase of TCM intervention group.Conclusion Certain anti-oxidative capability was shown to restrain oxidative stress in Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe,which has some protection to diabetic rat liver.

Diabetes;Rat;Liver;Oxidative stress; Nourishing Yin and Promoting Blood Flow Recipe

R587.2

A

1673-7210（2014）08（b）-0039-04

2014-04-23本文编辑：张瑜杰）

河北省沧州市科学技术研究与发展指导计划项目（编号08ZD240）。

杨晓晖（1975-），硕士；研究方向：细胞生物学、医学遗传学教学及研究。