酶联免疫斑点试验诊断结核性胸膜炎的临床应用价值

董 璇 李天兴 韩晓群 黄汉平

1.武汉市医疗救治中心结核性脑膜炎科，湖北武汉430012；2.武汉市医疗救治中心胸外科，湖北武汉430012；3.武汉市医疗救治中心感染科，湖北武汉430012；4.武汉市医疗救治中心结核呼吸科，湖北武汉430012

酶联免疫斑点试验诊断结核性胸膜炎的临床应用价值

董 璇1李天兴2韩晓群3黄汉平4

1.武汉市医疗救治中心结核性脑膜炎科，湖北武汉430012；2.武汉市医疗救治中心胸外科，湖北武汉430012；3.武汉市医疗救治中心感染科，湖北武汉430012；4.武汉市医疗救治中心结核呼吸科，湖北武汉430012

目的探讨酶联免疫斑点试验（ELISPOT）诊断结核性胸膜炎的临床应用价值。方法选择2011年8月～2012年8月武汉市医疗救治中心住院21例结核性胸膜炎患者（结核组）和18例肺癌胸膜转移患者（恶性肿瘤组），利用ELISPOT法检测两组患者胸水对结核特异性抗原刺激产生反应，分泌γ干扰素的效应T淋巴细胞的阳性率。结果ELISPOT结果显示结核组胸水中T淋巴细胞检测阳性率为85.7%（18/21），明显高于恶性肿瘤组[16.7%（3/18）]，差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISPOT的敏感性与特异性分别为85.7%、83.3%。结论ELISPOT灵敏性和特异性较高，对于结核性胸膜炎具有一定的临床诊断价值。

结核性胸膜炎；酶联免疫斑点试验；诊断

结核性胸膜炎是我国较为常见的一种疾病，它的发病率与结核病的疫情有密切关系[1]。因此它的及时诊断与治疗十分重要。但在临床工作中，由于目前诊断方法仍旧以胸水细胞学检查，胸水细菌学检查为主，常与其他性质的胸腔积液疾病如恶性胸腔积液难以区分[2-3]。随着对结核病发病机制的深入研究，以IFN-γ为基础的细胞免疫诊断成为研究热点.该诊断方法的理论基础是当结核菌致敏的T细胞再次遭遇人分枝杆菌抗原时可在体内产生IFN-γ。体外IFN-γ释放反应是用人结核分枝杆菌特异或非特异抗原体外刺激受检者全血或外周血单个核细胞，使少量T淋巴细胞充分接受刺激[4-5]，从而分泌大量IFN-γ，然后用酶联免疫吸附测定（ELISA）或酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测IFN-γ浓度或计数分泌的细胞的方法。本研究通过采用ELISPOT方法对临床诊断为结核性胸膜炎患者的胸腔积液及临床诊断为恶性胸水患者的胸腔积液进行产生γ干扰素的T细胞的检测，来探讨该方法在结核性胸膜炎诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2011年8月～2012年8月武汉市医疗救治中心（以下简称“我中心”）收治的21例结核性胸膜炎患者作为结核组，其中男13例，女8例，年龄为20～70岁，平均（40.0±5.5）岁。所有患者均符合以下诊断标准[1]：①有胸痛，胸闷，发热典型症状；②胸腔积液常规生化等检查提示为渗出液，结核抗体阳性，细胞学检查以淋巴细胞为主；③胸水涂片发现抗酸杆菌；④胸膜活检病理组织学检查提示肉芽肿或干酪病变；⑤初治抗结核方案治疗后症状好转，胸水吸收较明显。将我中心同期收治的18例肺癌胸膜转移患者作为恶性肿瘤组，男10例，女8例，年龄40～78岁，平均（59.0±4.5）岁。所有患者均经临床表现、胸液检查、影像学检查、病理组织学或细胞学确诊，两组性别、年龄一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经我中心伦理委员会通过，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 胸水中单个核细胞的提取及冻存用无菌方法采集100 mL胸水，室温，1800 r/min（r=5 cm），15 min离心得沉淀物。用等体积的无菌PBS或生理盐水重悬，混匀。用移液管加至装有等体积的淋巴细胞分离液（Ficoll淋巴细胞分离液，深圳达科为生物技术有限公司）的15 mL离心管内，室温2300 r/min（r=5 cm），30 min离心，用移液管小心吸取单个核细胞层至50 mL离心管，用40 mL的PBS或生理盐水洗涤，室温，1500 r/min（r=5 cm），10 min离心得沉淀。所有患者于采集标本前均未给予免疫抑制治疗。

1.2.2 ELISPOT检测按照结核杆菌感染T细胞酶联免疫斑点诊断试剂盒（深圳达科为生物技术有限公司）说明书，每孔加入200μL无血清培养基或RPMI-1640培养基，室温静置5～10 min，倾倒。加入细胞悬液：按照实验安排，结核性胸膜炎及恶性胸水每个测试样本需4孔，加入不同样本细胞，100μL/well。阴性对照：每孔加入10μL无血清培养基。阳性对照：每孔加入10μL PHA，测试孔A：每孔加入10μL结核杆菌特异混合多肽A。测试孔B：每孔加入10μL结核杆菌特异混合多肽B。孵育：当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37℃，5%CO2培养箱培养16～20 h后，裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加冰冷的去离子水，200μL/well，4℃冰箱放置10 min低渗裂解细胞。洗板后加入检测抗体孵育：每孔加入100μL稀释好的生物素标记的抗体，37℃孵育1 h。亲和素孵育：加入100μL稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1 h，洗板5次后，每孔加入100μL的显色液，室温避光静置15～45 min（20～25℃，显色25 min较合适）。将孔内的液体倒出，打开板底座，用不含离子的蒸馏水对正反面及底座部分反复洗涤3～5遍，终止后观察显色。将板置于在室内的阴凉处，避光，等待自然干燥后将底座关闭。采用ELISPOT板斑点计数，记录并分析ELISPOT斑点的各项指标。

1.3 结果判断

当测试孔A和（或）测试孔B达到下列标准则判定为阳性结果：①如果阴性对照孔斑点数为0～5个，用测试A和（或）测试孔B的斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6个；②如果阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔A和（或）测试孔B的斑点数必须≥2倍阴性对照孔斑点数。ELISPOT的敏感性=（阳性例数/总例数）%，特异性=[1-（阴性/阳性）]%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者胸水中T细胞反应阳性结果的比较

结核组中ELISPOT检测T细胞反应阳性率为85.7%（18/21），明显高于恶性肿瘤组[16.7%（3/18）]，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者胸水中T细胞反应阳性结果的比较[n（%）]

2.2 结核组ELISPOT的敏感性与特异性

结核组ELISPOT法结测的敏性性为85.7%，特异性为83.8%。

3 讨论

本研究发现结核组中T细胞反应阳性率为85.7%，明显高于恶性肿瘤组（16.7%），差异有统计学意义（P＜0.05）。ELISPT检验反应阳性的T细胞的特异性为85.7%，敏感性为83.3%，可作为结核性胸膜炎的一种新的诊断方法。

近年来有研究认为，结核性胸膜炎发病机制如下[6-7]：当机体遭受结核杆菌侵袭后会导致过敏反应的发生，并分泌特异性抗原，进一步对细胞免疫进行调节，如招募CD4+T淋巴细胞，并使之聚集于胸膜腔内，分泌各种细胞因子，作用于效应细胞（如巨噬细胞），并使之活化，通过吞噬作用将病原微生物局限在局部区域后吞噬消灭，同时胸膜的毛细血管网进一步充血，并发生渗出现象及伴随后来的炎症细胞的浸润。而再次过程中，IFN-γ是起着关键作用的细胞因子，IFN-γ的重要功能之一便是活化巨噬细胞，上调巨噬细胞表面分布的MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ协同刺激分子CD80/86等的表达程度，使巨噬细胞内的依赖性和非依赖性氧杀菌系统充分激活，使巨噬细胞获得了溶解消化胞内微生物的能力。与此同时，巨噬细胞的抗原递呈能力得到进一步强化，从而进一步地强化了对结核杆菌的免疫功能。从以上的理论基础不难看出结核性胸膜炎与IFN-γ之间存在着密切的联系。国内外研究报道显示测定胸水中IFN-γ浓度对诊断结核性胸膜炎具有较高的价值。如Villena等[5]，进行了包括595例患者，涵盖结核因素、恶性肿瘤、细菌感染、血管炎性、非干酪样肉芽肿、免疫损伤和器官移植排斥等多种因素在内的多项研究，结果显示胸腔积液中的IFN-γ含量水平在结核性胸膜炎诊断中具有非常高的意义，并确定了放免法胸腔积液中IFN-γ的cutoff值为3.7 kU/L，在此cutoff值下，敏感性和特异性均为98%。

然而，绝大多数研究是以ELISA、放免等方法测定胸腔积液中IFN-γ浓度，检测的是无生命的溶液中细胞因子的浓度，近年来，ELISPOT方法对结核病的诊断价值逐渐引起国内外学者的重视。不少研究发现利用结核特异性抗原如ESAT-6，CFP10刺激后，检测产生IFN-γ的T细胞的诊断方法对结核感染人群具有较高的敏感性和特异性，特别是对潜伏性结核，儿童结核病等特殊人群。Lalvani等[8]也认为该方法的敏感率达到了95%。而本实验采取的ELISPOT方法检测的便是T细胞分泌IFN-γ的功能，作为功能性检测，能直接反映细胞免疫功能。该检测方法在国内也已开始进入试验性诊断应用阶段，但对于国人常见的结核性胸膜炎却无相关报道。本实验采用ELISPOT检测法，用结核特异性抗原A肽，B肽作刺激物，检测胸水中对结核特异性抗原刺激有所反应并产生IFN-γ的T细胞的阳性率来探讨此方法对结核性胸膜炎的诊断价值.这是一个新的尝试，但样本量较小也是本研究需要改进之处。

本研究发现，结核性组T细胞反应阳性率明显高于恶性肿瘤组，提示T淋巴细胞分泌的IFN-γ在结核性胸膜炎发病机制中起着重要作用，这与过去的研究结果是相一致的，因此测定T细胞灵敏度较高的EISPOT检测如果应用于结核性胸膜炎的诊断中，对结核性胸膜炎的及时治疗有一定的帮助[9-11]，可以减少胸膜增厚，脓胸等并发症。同时对于由结核菌引起的其他浆膜腔积液疾病如结核性脑膜炎，结核性腹膜炎的诊断也将是新的借鉴。

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Clinical application value of ELISPOT in the diagnosis of tuberculous pleuritis

DONG Xuan1LI Tianxing2HAN Xiaoqun3HUANG Hanping4
1.Department of Tuberculous Meningitis,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China; 2.Department of Thoracic Surgery,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China;3.Department of Infectious Disease,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China;4.Department of Respiratory Tuberculosis,Wuhan Medical Treatment Center,Hubei Province,Wuhan 430012,China

ObjectiveTo investigate the clinical application value of ELISPOT in the diagnosis of tuberculous pleuritis.Methods 21 patients with tuberculous pleuritis in Wuhan Medical Treatment Center from August 2011 to August 2012 were selected as tuberculosis group,18 patients with lung cancer and pleural metastasis were selected as malignant tumor group.ELISPOT method was used to detect the pleural effusion,peripheral blood in tuberculosis group and pleural effusion in malignant tumor group;the tuberculosis specific antigen stimulation reactions was observed;the positive rate of T lymphocyte with secreting gamma interferon were observed.ResultsT lymphocyte testing positive rate in tuberculosis group 85.7%(18/21),significant higher than that of tuberculosis group[16.7%(3/18)]according to the ELISPOT results,the difference was statistically significant(P＜0.05).The sensitivity and specificity of ELISPOT were 85.7% and 83.3%repectively.ConclusionELSPOT is a sensitive and specific detection method of tuberculosis pleuritis,it has clinical diagnostic value.

Tuberculous pleuritis;ELISPOT;Diagnosis

R446.61

A

1673-7210（2014）03（b）-0091-03

2013-11-21本文编辑：任念）

湖北省武汉市卫生局科研课题（编号WX12C15）。

董璇（1976.10-），女，湖北武汉人，硕士；研究方向：结核呼吸。