GLP-1受体激动剂对老龄大鼠骨质疏松的防治作用

王 宁 马 雪 孟静茹 贾 敏 罗晓星

第四军医大学药学院药理学教研室，陕西西安710032

GLP-1受体激动剂对老龄大鼠骨质疏松的防治作用

王 宁 马 雪 孟静茹 贾 敏 罗晓星

第四军医大学药学院药理学教研室，陕西西安710032

目的观察胰高血糖素样肽-1受体激动剂（Exendin-4）对老龄大鼠骨质疏松的防治作用。方法选取32只增龄不同阶段的雄性SD大鼠（4、20个月龄），每组各16只，将各年龄段大鼠再随机分为对照组（生理盐水，8只）和药物治疗组[Ex-4，1 nmol/（kg·d），8只]，持续给药12周，测定血清中骨代谢相关的生化指标；进行骨组织切片、双染、骨形态计量学分析及骨生物力学性能测试。结果Ex-4可以显著增加老龄大鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度、骨小梁间隙、结构模型指数、最大载荷、刚度、压力、弹性模量、血清钙、尿钙/肌酐、尿磷/肌酐、碱性磷酸酶、骨钙素、骨矿化率、骨形成率，各数据依次为：（330.88±27.47）mg/cm3，（35.88±4.35）%，（3.1312± 0.2487）个/mm，（0.1275±0.0103）mm，（0.2125±0.0349）mm，（1.4275±0.1462），（106.38±11.64）N，（154.88±13.67）N/mm，（108.13±9.73）MPa，（3.1063±0.1399）GPa，（2.7438±0.2109）mmol/L，（0.1513±0.0180），（3.1500±0.3380），（133.50± 14.19）U/L，（39.63±3.50）ng/mL，（1.088±0.172）μm/d，（0.3500±0.0292）μm/d，均相应高于对照组[（249.50±26.72）mg/cm3，（25.38±3.66）%，（2.2950±0.2554）个/mm，（0.1038±0.0168）mm，（0.4000±0.0292）mm，（2.0425±0.2360），（74.88±8.87）N，（99.38±9.66）N/mm，（73.13±7.14）MPa，（2.0050±0.1616）GPa，（2.3363±0.3010）mmol/L，（0.2475±0.0225），（4.5200± 0.2512），（89.75±9.06）U/L，（32.13±3.04）ng/mL，（0.663±0.140）μm/d，（0.2675±0.0380）μm/d]，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论Exendin-4对老龄大鼠骨质疏松具有明显的防治作用。

胰高血糖素样肽-1；老龄；骨质疏松；骨密度；显微CT

骨质疏松症（OP）是老年人的常见病和多发病，全球50岁以上人群中，1/3女性和1/5男性患有骨质疏松，随着人口老龄化形势日趋严峻，骨质疏松及相关骨折已成为世界各国政府高度重视的全球性公共卫生问题。大量临床研究数据显示，随着年龄的增加，骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化的能力受到抑制，向脂肪细胞分化的比例增加，骨髓脂肪细胞的大小和数量呈线性上升[1]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是肠道L细胞分泌的由30个氨基酸残基组成的肽类激素[2]，通过多种途径参与血糖调节，对维持机体的葡萄糖稳态起着十分重要的作用[3]。笔者在前期研究中发现，GLP-1受体激动剂（Exendin-4，Ex-4）能够促进BMSCs向成骨细胞分化，增加成骨细胞数量，具有促进骨形成作用[4]。本实验研究将在老龄骨质疏松大鼠上观察Ex-4的疗效及其促成骨作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备

Cobas Integra 400 Plus全自动生化仪（Roche Diagnostics公司，瑞士）；eXplore Locus SP Pre-Clinical Specimen显微CT（GE healthcare公司，美国）；MTS 858 Mini Bionix材料测试仪（MTS公司，美国）；Leica SP1600硬组织切片机（Leica公司，德国）；Model 680型酶标仪（BIO-RAD公司，美国）；Biofuge fresco冷冻高速台式离心机（SORVALL公司，美国）；Alpha FluorChem SP成像系统（Alpha公司，美国）；Milli-Q超纯水系统（MILLIPORE公司，美国）。

1.2 动物与药品

SD大鼠，雄性，32只，包括青年（4个月龄）16只，体重250～300 g，老年（20个月龄）16只，体重650～700 g，由第四军医大学实验动物中心提供。饲养环境：温度（23.0±2.0）℃，湿度（55±5）%，光照7∶00～19∶00。动物进行适应性训练1周后使用。Ex-4（美国多肽公司，美国）；四环素；钙黄绿素。

2 方法与结果

2.1 方法

将各组大鼠（16只）分别随机分为两小组，药物治疗组（8只）及对照组（生理盐水）（8只），分别给予Ex-4及生理盐水处理，剂量均为1 nmol/（kg·d）。

2.1.1 样本收集各组大鼠连续给药12周后，采用3%戊巴比妥钠麻醉，腹腔动脉抽血5～6 mL置于肝素试管中抗凝，离心出血清（3000 r/min，15 min），-20℃保存。给药结束前1 d，将大鼠放入代谢笼中，收集24 h空腹尿液，-20℃保存。大鼠处死前称体重，处理后取双侧股骨及胫骨盐水纱布包埋后置于-20℃保存。

2.1.2 血清及尿液生化指标检测各大鼠连续给药12周后收取血液和尿液，进行骨代谢生化指标的测定。采用全自动生化仪测定血钙（S-Ca）、血磷（S-P）、尿钙（U-Ca）、尿磷（U-P）的水平；ELISA试剂盒测定血清骨特异性碱性磷酸酶（BALP）及骨钙素（OCN）水平。

2.1.3 显微CT（Micro CT）分析取右侧股骨，4%多聚甲醛固定24 h后置70%酒精中保存，采用Micro CT分析骨密度、骨矿物含量及骨微结构的变化，扫面层厚0.1 mm，分辨率10 μm，主要指标包括：骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁间隙及材料结构模型指数。

2.1.4 生物力学测定取左侧股骨，用生理盐水纱布包裹后置入-20℃保存，测定时取出放入生理盐水中，室温（20℃）下浸泡复温3～4 h，采用三点弯曲试验方法，应用MTS BioNix 858Ⅱ型万能材料试验机进行测试，置左股骨于跨距为10 mm的支架上，以1 mm/min的速度下压股骨中段，记录载荷-变形曲线，并测量股骨中段的内外径。

2.1.5 不脱钙组织包埋及骨矿沉积率测定动物处死前第13、14天皮下注射四环素（25 mg/kg）和第3、4天分别皮下注射注钙黄绿素（5 mg/kg）做荧光标记。取左侧胫骨70%乙醇固定，再经乙醇逐级脱水。用甲基丙烯酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯（软化剂）和催化剂包埋不脱钙骨。包埋标本用硬组织切片机沿股骨矢状面切片，切片厚度为5 μm。用自动图像分析系统测量黄色荧光和绿色荧光标记带间距，计算各组各时间点的骨矿沉积率（骨矿沉积率=两条荧光标记线之间距离/标记间隔时间），通过分析骨矿沉积速度考察骨形成活力。

2.1.6 统计学方法采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.2 结果

2.2.1 骨组织Micro CT分析应用Micro CT进行骨形态计量学分析，结果显示老年大鼠（20个月龄）与青年大鼠（4个月龄）相比，骨密度显著降低，骨小梁微结构破坏严重，提示应用Ex-4可以显著增强骨密度，改善骨小梁微结构的破坏（图1）。其中老年大鼠和青年大鼠骨密度值：生理盐水（249.50±26.72）、（497.88± 41.701）mg/cm3，老年大鼠给药前后骨密度值（249.50± 26.72）、（330.88±27.47）mg/cm3，经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠和青年大鼠骨体积分数：生理盐水（25.38±3.66）%、（45.00±3.70）%，老年大鼠给药前后骨体积分数（25.38±3.66）%、（35.88± 4.35）%，经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠和青年大鼠骨小梁数量：生理盐水（2.2950± 0.2554）、（4.1275±0.3123）个/mm，老年大鼠给药前后骨小梁数量（2.2950±0.2554）、（3.1312±0.2487）个/mm，经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠和青年大鼠骨小梁厚度：生理盐水（0.1038±0.0168）、（0.1588±0.0203）mm，老年大鼠给药前后骨小梁厚度（0.1038±0.0168）、（0.1275±0.0103）mm，经比较，异均有统计学意义（P＜0.05）；老年大鼠和青年大鼠骨小梁间隙：生理盐水（0.4000±0.0292）、（0.1513± 0.0180）mm，老年大鼠给药前后骨小梁间隙（0.4000± 0.0292）、（0.2125±0.0349）mm，经比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠和青年大鼠材料结构模型指数：生理盐水（2.0425±0.2360）、（0.9050±0.0883），老年大鼠给药前后材料结构模型指数（2.0425± 0.2360）、（1.4275±0.1462），经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。

图1 大鼠骨小梁显微结构的Micro CT分析（n=8）

2.2.2 骨生物力学指标测定采用三点弯曲试验，应用MTS BioNix 858Ⅱ型万能材料试验机进行骨生物力学分析，研究结果显示，Ex-4能够显著改善老年大鼠（20个月龄）股骨的生物力学特性，增强股骨的机械强度（图2）。其中老年大鼠、青年大鼠最大负荷：生理盐水（74.88±8.87）、（135.00±14.182）N，老年大鼠给药前后最大负荷（74.88±8.87）、（106.38±11.64）N，经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠与青年大鼠刚度：生理盐水（99.38±9.66）、（200.63± 15.25）N/mm，老年大鼠给药前后刚度（99.38±9.66）、（154.88±13.67）N/mm，经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠与青年大鼠应力：生理盐水（73.13±7.14）、（135.25±9.16）MPa，老年大鼠给药前后应力（73.13±7.14）、（108.13±9.73）MPa，经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠与青年大鼠弹性模量：生理盐水（2.0050±0.1616）、（3.9838± 0.2237）GPa，老年大鼠给药前后弹性模量（2.0050± 0.1616）、（3.1063±0.1399）GPa，经比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。

图2 大鼠股骨的结构和材料特性（n=8）

2.2.3 血液及尿液生化指标检测采用Integra 400 plus型全自动生化分析仪测定血清Ca、P及尿液Ca、P，ELISA方法检测血清骨特异性碱性磷酸酶（BAP）和骨钙素（OCN），结果表明，Ex-4可以显著减少老年大鼠（20个月龄）尿液中钙磷流失，升高血清中BAP和OCN水平，提示GLP-1抑制破骨细胞活动的同时可能促进了成骨细胞活性（图3）。其中，老年大鼠与青年大鼠血清钙：生理盐水（2.3363±0.3010）、（2.8063±0.1883）mmol/L，老年大鼠给药前后血清钙（2.3363± 0.3010）、（2.7438±0.2109）mmol/L，经比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；老年大鼠与青年大鼠血清磷：生理盐水（1.5012±0.1433）、（1.6075±0.1439）mmol/L，老年大鼠给药前后血清磷（1.5012±0.1433）、(1.6075± 0.1689)mmol/L，经比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；老年大鼠与青年大鼠尿钙/肌酐：生理盐水（0.2475± 0.0225）、（0.0713±0.0145），老年大鼠给药前后尿钙/肌酐（0.2475±0.0225）、（0.1513±0.0180），经比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠与青年大鼠尿磷/肌酐：生理盐水（4.5200±0.2512）、（2.7850±0.1544），老年大鼠给药前后尿磷/肌酐（4.5200±0.2512）、（3.1500± 0.3380），经比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠与青年大鼠血清骨特异性碱性磷酸酶：生理盐水（89.75±9.06）、（169.00±13.59）U/L，老年大鼠给药前后血清骨特异性碱性磷酸酶（89.75±9.06）、（133.50± 14.19）U/L，经比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠与青年大鼠血清骨钙素：生理盐水（32.13± 3.04）、（53.88±4.88）ng/mL，老年大鼠给药前后血清骨钙素（32.13±3.04）、（39.63±3.50）ng/mL，经比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

图3 血液及尿液中骨代谢相关生化指标的测定（n=8）

2.2.4 骨形成活力分析采用钙黄绿素和四环素双荧光标记法，通过分析骨矿沉积速度考察骨形成活力。结果显示，Ex-4可以提高老年大鼠（20个月龄）骨形成率（BFR）和骨矿化率（MAR）（图4），提示GLP-1具有促进骨形成的作用。其中老年大鼠与青年比较骨矿沉积率：生理盐水（0.663±0.140）、（1.338±0.244）μm/d，老年大鼠给药前后骨矿沉积率（0.663±0.140）、（1.088± 0.172）μm/d，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；老年大鼠与青年大鼠骨形成率：生理盐水（0.2675±0.0380）、（0.4450±0.0661）μm/d，老年大鼠给药前后骨形成率（0.2675±0.0380）、（0.3500±0.0292）μm/d，经比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

图4 双荧光素标记分析大鼠股骨（n=8）

骨质疏松的本质是骨重建过程中骨形成与骨吸收失衡，成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨的动态平衡是维持正常骨量的关键[4]，这一骨重建过程贯穿整个生命进程，并受多种因素调控，其中肠道激素在骨重建过程中发挥着重要的调节作用[5]。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）、GLP-1和GLP-2是三种具有重要生物学作用的肠道激素，都是随营养物质摄入后由肠道内分泌细胞分泌产生的。研究发现，肠道K细胞分泌的GIP具有促进骨形成和抑制骨吸收的作用，进一步研究证实在成骨和破骨细胞上都存在GIP受体，激动该受体可直接促进成骨细胞增殖并抑制其凋亡[6-7]。新近研究发现，肠道L细胞分泌的GLP-2可直接作用于破骨细胞的GLP-2受体，抑制骨吸收[8]；临床研究数据显示，GLP-2能够显著改善妇女绝经后骨质疏松[9]。此外，长期肠外营养支持治疗的患者出现骨量明显减少、骨密度和骨强度降低等骨质疏松的典型表现[10-11]。上述研究结果强烈提示，肠道激素在维持正常骨量和骨重建平衡中发挥重要作用，是“肠-骨轴”调节通路中的重要信号分子。

成年人骨骼中的BMSCs主要向成骨细胞和脂肪细胞两个方向分化，维持二者间正常的分化比例，对维持正常骨量至关重要。随着年龄的增长，BMSCs向脂肪细胞分化的比例增加，成骨细胞数量相对减少，成骨作用减弱，导致骨量降低[12]。新近研究发现，BMSCs上存在GLP-1受体，激动该受体能够抑制BMSCs向脂肪细胞分化[3]，提示GLP-1及其受体对BMSC的分化方向具有重要调控作用。笔者在前期研究中发现Ex-4能够促进BMSCs向成骨细胞分化，继而促进骨形成作用。

自然衰老动物的增龄性骨质疏松与人类老年性骨质疏松的病理表现最为相似。大鼠的生命周期一般为3～4年，6个月龄以后股骨骨密度与钙的变化已相当小，到12个月龄时各项骨参数均已达平台水平[13]，随后骨密度开始降低，但比较缓慢。Wang等[14]认为，9个月龄时雄性SD大鼠骨骼已完全成熟，与增龄相关的骨丢失从此刻即已发生，这一过程与男性骨质疏松类似，故推荐超过9个月龄的雄性SD大鼠即可作为增龄性骨丢失模型。因此，本研究选取增龄不同阶段的雄性SD大鼠作为实验对象，研究发现Ex-4能够显著增强老龄大鼠的骨密度，改善大鼠增龄过程中骨小梁微结构的破坏；改善老龄大鼠股骨的生物力学特性，增强股骨的机械强度；显著减少老龄大鼠尿液中钙磷流失，升高血清中BAP和OCN水平，提示GLP-1抑制破骨细胞活动的同时可能促进了成骨细胞活性。Ex-4可以提高老龄大鼠骨形成率和骨矿化率，表明GLP-1具有促进骨形成的作用。

综上所述，本研究认为，Ex-4对于老年性骨质疏松动物模型雄性增龄SD大鼠而言，具有明显的骨形成促进作用，即对老年性骨质疏松具有很好的防治作用。

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Prevention and therapeutic effect of a GLP-1 receptor agonist in aging rats with osteoporosis

WANG NingMA XueMENG JingruJIA MinLUO Xiaoxing
Department of Pharmacology,School of Pharmacy of Fourth Military Medical University,Shannxi Province,Xi′an 710032,China

ObjectiveTo investigate the prevention and therapeutic effect of GLP-1R agonist for exendin-4 in aging rats with osteoporosis.Methods32 male SD rats(4,20-month-old)were divided into two groups:the control group (injected with saline for 12 weeks,8 rats),the Exendin-4-treated group[ip,injected with Ex-4 at the dose of 1 nmol/(kg·d) for 12 weeks,8 rats].Serum and urinary samples were taken for assessment of biochemical parameters.Femurs were removed for bone analysis,including trabecular bone microarchitecture by Micro-computed tomography(Micro CT)and biomechanical properties by three-point bending and axial compression tests.ResultsExendin-4 remarkably promoted the BMD,BV/TV,Tb.N,Tb.Th,Tb.Sp,SMI,maximum load,stiffness,stress,modulus of elasticity,serum Ca,urinary Ca/Cr,urinary P/Cr,serum BAP,serum OCN,MAR,BFR/BS level,which were（330.88±27.47）mg/cm3，（35.88±4.35）%，（3.1312±0.2487）1/mm，（0.1275±0.0103）mm，（0.2125±0.0349）mm，（1.4275±0.1462），（106.38±11.64）N，（154.88± 13.67）N/mm，（108.13±9.73）MPa，（3.1063±0.1399）GPa，（2.7438±0.2109）mmol/L，（0.1513±0.0180），（3.1500± 0.3380），（133.50±14.19）U/L，（39.63±3.50）ng/mL，（1.088±0.172）μm/d，（0.3500±0.0292）μm/d，which were significantly higher than those in the control group with the value of（249.50±26.72）mg/cm3，（25.38±3.66）%，（2.2950± 0.2554）/mm，（0.1038±0.0168）mm，（0.4000±0.0292）mm，（2.0425±0.2360），（74.88±8.87）N，（99.38±9.66）N/mm，（73.13± 7.14）MPa，（2.0050±0.1616）GPa，（2.3363±0.3010）mmol/L，（0.2475±0.0225），（4.5200±0.2512），（89.75± 9.06）U/L，（32.13±3.04）ng/mL，（0.663±0.140）μm/d，（0.2675±0.0380）μm/d.The differences were all statistically significant(all P＜0.05).ConclusionThe antiosteoporotic effects of Exendin-4 in old rats is obvious.

GLP-1;Senile;Osteoporosis;BMD;Micro CT

R580

A

1673-7210（2014）04（c）-0004-05

2013-11-28本文编辑：卫轲）

国家自然科学基金资助项目（编号81100626、81201515）。

王宁（1989.1-），男，山东苍山人，第四军医大学药学院2011级药理学专业在读硕士研究生。

罗晓星（1955.2-），男，河北任丘人，博士，教授，第四军医大学药学院副院长；研究方向：分子药理。