rhGM-CSF和纳米银联合外用对深Ⅱ度烫伤创面病原菌的影响

杨景哲 王 芳 耿琪瑛 陈凤平 冯欣姝 温海玲

承德医学院附属医院烧伤整形科，河北承德067000

rhGM-CSF和纳米银联合外用对深Ⅱ度烫伤创面病原菌的影响

杨景哲▲王 芳▲耿琪瑛 陈凤平 冯欣姝 温海玲

承德医学院附属医院烧伤整形科，河北承德067000

目的研究重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和纳米银联合外用，对深Ⅱ度烫伤创面愈合过程病原菌分布及其耐药性分析。方法用Wistar大鼠建立深Ⅱ度烫伤模型，分为A、B、C、D四组，A组（30例）：凡士林纱布覆盖，B组（30例）：纳米银覆盖，C组（30例）：rhGM-CSF涂抹创面，D组（30例）：rhGM-CSF+纳米银覆盖，伤后第1、4、7、10、14、21天，创面分泌物细菌培养并计数，细菌分离鉴定，测定细菌耐药谱。结果A组在第4、7、10、14、21天均培养出细菌[（3.22±1.04）×104/cm2、（4.57±1.15）×104/cm2、（8.13±1.25）×104/cm2、（16.36±3.22）× 104/cm2、（14.52±3.10）×104/cm2]；B、C两组在第10、14、21天培养出细菌[B组：（5.67±0.77）×104/cm2、（8.14±1.21）× 104/cm2、（6.86±0.96）×104/cm2；C组：（4.38±1.44）×104/cm2、（6.80±0.85）×104/cm2、（4.94±0.40）×104/cm2]；D组在第14、21天培养出细菌[（4.10±0.47）×104/cm2、（2.46±0.76）×104/cm2]。第10、14、21天，A、B、C、D组细菌计数比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌居首位；革兰阴性菌以铜绿假单胞菌居首位。药敏试验结果显示，金黄色葡萄球菌主要对青霉素G、环丙沙星、利福平、苯唑西林、氧氟沙星、庆大霉素、四环素等耐药，铜绿假单胞菌主要对哌拉西林、奈替米星、头孢吡肟、哌拉西林他唑巴坦、庆大霉素等耐药，病原菌对抗菌药物敏感性均为D组＞C组＞B组＞A组。结论rhGM-CSF和纳米银联合外用，减少深Ⅱ度烫伤创面细菌生长，提高病原菌对抗菌药物的敏感性。

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；纳米银；烧伤创面；病原菌；耐药性

烧（烫）伤是常见的机体损伤，随着诊疗技术的进步，以前困扰烧伤治疗的休克期复苏，因量化公式、容量监测仪器的应用，而逐渐成熟，而烧伤创面外用敷料种类繁多，但是如何合理有效利用，至今在烧伤治疗方面仍是一个盲区。rhGM-CSF和纳米银联合外用通过调节机体免疫系统、启动免疫应答，可控制烧伤创面炎性反应。而深Ⅱ度创面在愈合过程中溶痂极易感染，致创面加深，同时长期抗生素应用，致耐药菌群比例增高，残余创面经久不愈。因此合理的创面外用药物，直接影响深Ⅱ度烧伤创面的愈合周期及整体治疗的病程和转归。而rhGM-CSF和纳米银联合外用治疗深Ⅱ度烧伤创面，一方面可以控制感染，减轻创面炎症反应，加速创面愈合；另一方面可以减少抗生素的使用量，缩短治疗周期，降低治疗费用，对烧伤整体治疗有积极意义，对抢救生命至关重要。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

Wistar大鼠120只，200～220 g，雌雄各半，由天津山川红实验动物科技有限公司购买。水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉，背部去毛后用99℃纱布覆盖10 s，造成4 cm×4 cm大小深Ⅱ度烫伤创面（病理切片证实），伤后创面分别用A、B、C、D四种方法处理，每组30只，A组：凡士林纱布覆盖，B组：生理盐水湿润纳米银医用抗菌敷料（购买自深圳市爱杰特医药科技有限公司）覆盖，C组：rhGM-CSF（购买自长春金赛药业有限公司）涂抹创面，D组：rhGM-CSF+纳米银敷料覆盖，创面无菌敷料包扎，每天换药，分别于伤后第1、4、7、10、14、21天留取创面分泌物标本，至第21天，终止实验。

1.2 主要仪器及试剂

电热恒温培养箱（DNP-9272，上海精宏实验设备有限公司），细菌培养仪（Bact/ALERT 3D培养仪，法国梅里埃公司），细菌鉴定仪（VITEK2TM-compact，法国梅里埃公司），药敏试验所用药敏纸片（英国OXOID公司），药物敏感标准菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯杆菌ATCC700603，原卫生部临床检验中心细菌室）。

1.3 创面细菌培养、计数

创面分泌物用咽拭子涂抹整个创面，注射用水10 mL浸泡，分别取其中的10 μL在9 cm血平板（中国蓝琼脂+血琼脂）及麦康凯平皿上均匀划线，在37℃电热恒温培养箱孵育24 h，菌落计数，运用细菌鉴定仪根据革兰染色镜检及生化鉴定。

1.4 药敏试验

根据美国临床实验室标准协会（CLSI，2011年版）标准，采用纸片扩散法（K-B法）进行试验及结果判定。选择抗生素纸片为青霉素G、苯唑西林、哌拉西林、阿莫西林、克林霉素、头孢呋辛钠、红霉素、万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、四环素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢哌酮舒巴坦、头孢西丁、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、利福平、阿米卡星、奈替米星、米诺环素、氯霉素。

按照CLSI要求，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测采用30 μg头孢西丁进行检测，针对凝固酶阳性葡萄球菌，测其抑菌环直径≤21 mm判断为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），＞21 mm判断为耐甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）。

1.5 统计学方法

运用SPSS 16.0进行统计学分析。各组间不同时相点差异采用F检验，两两比较行SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面细菌培养及计数统计

在伤后第1天创面细菌培养中，各组创面均无细菌生长，A组在第4天培养有细菌生长，B组、C组在第10天培养有细菌生长，D组在第14天培养有细菌生长。组间比较，第10、14、21天，F值分别为36.28、43.59、48.14，各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。组内比较，第10、14、21天，B组与C组细菌计数差异无统计学意义（q值分别为1.82、1.63、2.15，均P＞0.05）；第10、14、21天，A组与B组、C组、D组，B组与D组，C组与D组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 各组不同时间点细菌数量比较（×104/cm2，x±s）

2.2 病原菌分布情况

A组在第4天出现细菌培养阳性，B、C组均在第10天细菌培养阳性，D组在第14天细菌培养阳性，在培养菌群中，革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌为主；革兰阴性菌以铜绿假单胞菌、不动杆菌、大肠埃希菌为主，不动杆菌的毒性较弱，临床症状不明显；真菌以白色念珠菌为主。A、B、C、D组在第14、21天均培养有细菌生长，分别对第14、21天病原菌分布情况进行分析，各组中，革兰阳性菌均为金黄色葡萄球菌检出率最高，革兰阴性菌均为铜绿假单胞菌检出率最高。随着治疗时间的延长，各组创面的不断缩小，细菌总数不断减少，但是A组极易耐药的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检出率在增高，B组基本持平，而C、D组在下降。病原菌分布情况见表2。

表2 各组不同时间创面病原菌分布情况[n（%）]

2.3 主要病原菌药物耐药率统计

药敏试验结果显示，革兰阳性菌主要对青霉素G、环丙沙星、利福平、苯唑西林、氧氟沙星、庆大霉素、四环素等耐药，革兰阴性菌主要对哌拉西林、奈替米星、头孢吡肟、哌拉西林他唑巴坦、庆大霉素等耐药。

2.3.1 金黄色葡萄球菌对常见抗菌药物的耐药率统计在第14、21天，A组金黄色葡萄球菌检出率最高，分别为36.7%及43.3%，D组最低，分别为23.3%及20.0%，对利奈唑胺、替考拉宁敏感，并且对于其他药物敏感性均为D组＞C组＞B组＞A组。金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药率见表3。

表3 各组第14、21天创面金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药情况[n（%）]

2.3.2铜绿假单胞菌对常见抗菌药物的耐药率在第14、21天，A组铜绿假单胞菌检出率最高，分别为16.7%及20.0%，D组最低，均为13.3%，对头孢哌酮舒巴坦和美罗培南敏感性较高，对哌拉西林、奈替米星、头孢吡肟完全耐药，并且对于其他药物敏感性均为D组＞C组＞B组＞A组。铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药率见表4。

3 讨论

烧伤发生后细菌的移位、感染是烧伤治疗面临的首要问题，而深Ⅱ度烧伤感染易导致创面加深、残余创面不愈。创面感染是最常见的烧伤感染来源，烧伤患者皮肤、黏膜受损，屏障作用遭到破坏，正常皮肤表面有大量细菌，烧伤后很难避免细菌感染，而且坏死组织的液化和炎性物质的渗出，致使损伤表面营养丰富，为感染菌生长提供了有利条件。同时在烧伤治疗过程中各种有创操作的进行，如动静脉置管、留置导尿、气管切开、呼吸机的使用，使烧伤患者对病原菌易感性增加[1]，滥用抗菌药物除导致敏感性细菌产生耐药外，还破坏了人体内的微生态平衡，造成“条件致病菌”成为烧伤创面感染的病原菌[2]。各个地区的烧伤感染病原菌的种类分布和耐药状况不尽相同，并有不同的变异趋势。所以，烧伤创面感染的预防与控制对于患者的治疗、预后有十分重要的意义。

表4 各组第14、21天创面铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药情况[n（%）]

rhGM-CSF作为基因工程产物，通过调节机体免疫系统，启动炎症细胞因子，增强机体的免疫力[3]，改善创面局部炎性趋化反应。rhGM-CSF局部外用可吸引炎症细胞及修复细胞至创面，活化中性粒细胞、单核/巨噬细胞，增强其吞噬和分泌功能，提高创面自身的抗感染能力，从而在适度炎性反应下介导创面愈合[4-5]。纳米银敷料是采用纳米技术，将单质银制成粒径约为25 nm的银微粒，银与菌体蛋白中的巯基（-SH）结合，引起其变性，使巯基酶失活发挥其广谱抗菌作用。rhGM-CSF和纳米银敷料相结合，细菌耐药性分析提示，并没有出现广泛耐药菌群的出现，对于较少创面细菌生长、控制创面炎性反应方面有优势。

深Ⅱ度烧伤创面临床治疗过程中，烧伤感染以细菌为主，长期广谱抗生素的应用，后期可能出现真菌感染。本组资料显示，金黄色葡萄球菌在革兰阳性菌居首位，铜绿假单胞菌在革兰阴性菌居首位，且二者极易出现耐药性，与大部分烧伤病房病原学研究相一致[6-7]，也有不同的研究结果，而高玲等[8]研究提示，革兰阴性菌中不动杆菌比例最高，吴肖峰[9]烧伤创面研究发现，革兰阴性菌铜绿假单胞菌居首位，紧随其后的是革兰阳性菌金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌，说明烧伤创面细菌感染菌株组成具有一定的地区差异。Fadeyibi等[10]在尼日利西南部的研究提示铜绿假单胞菌比例最高，并且明显高于金黄色葡萄球菌，而本课题实验结果提示，革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌比例明显高于铜绿假单胞菌。创面治疗过程中第14、21天，也是溶痂后创面愈合阶段，A、B组革兰阳性菌比例较高，而C、D组革兰阴性菌比例较高，革兰阳性菌的大量生长，不利于创面炎性反应及全身性感染的控制。rhGM-CSF和纳米银联合外用，协同的抑菌作用，在很大程度上减少细菌生长，控制烧伤后创面炎性反应方面相得益彰。

rhGM-CSF和纳米银联合外用不会增加耐药菌的产生，而目前烧伤创面治疗过程中，大量广谱抗生素的应用，易致金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌等多重耐药的产生，并且金黄色葡萄球菌成为烧伤感染的优势菌群，耐药细菌的种类和数量在增加[11]，尤其是临床抗菌药物的不合理应用和开放性有创操作，使抗生素的耐药率逐渐上升，同时MRSA的检出率也逐年上升[12]，在金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌耐药菌群分析中可以看出，在烧伤治疗第14天，即创面开始溶痂愈合时，正常治疗的敏感抗生素已经出现大量耐药的情况，利奈唑胺和替考拉宁仍保持对金黄色葡萄球菌的敏感性，美罗培南和头孢哌酮舒巴坦对铜绿假单胞菌有较高敏感性，第21天，耐药抗生素比例降低，尤其是D组，与创面大部愈合、溶痂期结束、感染控制有关，rhGM-CSF和纳米银联合外用有效的抑制了深Ⅱ度烧伤创面细菌的生长和耐药菌产生，所以在适量抗生素应用的前提下，rhGM-CSF和纳米银联合外用作为合理的创面外用敷料，可以减轻烧伤后创面感染，减少烧伤后耐药菌群的产生，缩短抗生素的使用时间，对临床工作有很大的指导和帮助。

烧伤创面外用敷料的研究逐渐趋向复合生物材料，并且在临床上效果已经得到了广泛认可和支持，但是更全面、多中心临床试验工作的展开，是指导临床工作的前提，有待全面开展。

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Effect of recombinant human Granulocyte/macrophage colonystimulating factor combined with nano-silver for deep burn degreenⅡabout pathogens

YANG Jingzhe▲WANG Fang▲GENG QiyingCHEN FengpingFENG XinshuWEN Hailing
Department of Burns and Plastic Surgery,the Affiliated Hospital of Chengde Medical University,Hebei Province, Chengde067000,China

ObjectiveTo study the distribution and drug resistance of the pathogens,about recombinant human Granulocyte/macrophage colonystimulating factor(rhGM-CSF)combined with nano-silver as a treatment for deep burn degreenⅡ.MethodsThe burn model were done with Wistar rats.They were randomly divided into four groups,petrolatum treatment(group A,n=30),nano-silver treatment(group B,n=30),rhGM-CSF treatment(group C,n=30),and rhGM-CSF combined with nano-silver treatment(group D,n=30).Bacteria were cultured,isolated identified,and determined antibiotics spectrum,on postburn day 1,4,7,10,14,21 in all groups.ResultsThere were bacterias in group A on postburn day 4,7,10,14,21[(3.22±1.04)×104/cm2,(4.57±1.15)×104/cm2,(8.13±1.25)×104/cm2,(16.36±3.22)×104/cm2, (14.52±3.10)×104/cm2].There were bacterias in group B and group C on postburn day 10,14,21[group B:(5.67±0.77)× 104/cm2,(8.14±1.21)×104/cm2,(6.86±0.96)×104/cm2;group C:(4.38±1.44)×104/cm2,(6.80±0.85)×104/cm2,(4.94±0.40)× 104/cm2].There were bacterias in group D on postburn day 14,21[(4.10±0.47)×104/cm2,(2.46±0.76)×104/cm2].Among group A,B,C and D,on postburn day 10,14,21,there were significantly statistical difference(P＜0.05).Staphylococcus aureus was the most in gram-positive bacteria. Pseudomonas aeruginosa was the most in gram-negative bacteria.The results of susceptibility test indicated that Staphylococcus aureus were resistant to Penicillin G, Ciprofloxacin,Rifampicin,Oxacillin,Ofloxacin,Gen-tamicin,and Teteacycline,while Pseudomo-nas aeruginosa were resistant to Piperacillin,Netilmicin,Cefepime, Piperacillin tazobactam,and Gentamicin.The antimicrobial susceptibility testing:group D＞group C＞group B＞group A.ConclusionrhGM-CSF combined with nano-silver treatment can reduce bacteria growth,improve the antimicrobial susceptibility of pathogens.

Recombinant human Granulocyte-macrophage colony stimulating factor;Nano silver;Burn wound;Pathogen; Drug resistance

R644

A

1673-7210（2014）04（c）-0012-05

2013-11-24本文编辑：卫轲）

河北省医学科学研究课题计划项目（编号20130024）；河北省承德市科学技术研究与发展计划（自筹经费）项目（编号20122164）。

▲共同第一作者

耿琪瑛（1954.2-），女，河北承德人，教授；研究方向：主要从事烧伤创面异体皮应用及难愈性创面治疗的研究。