红色毛癣菌菌落表型和基因型的分型研究

闫 玮占 萍陈 伟胡素泉刘维达∗

·论著·

红色毛癣菌菌落表型和基因型的分型研究

闫 玮1占 萍2陈 伟1胡素泉1刘维达1∗

目的: 确定红色毛癣菌菌落表型和基因型的相关性以及与感染部位的关系。方法: 收集红色毛癣菌临床分离株138株,采用传统培养方法对红色毛癣菌进行表型分型,利用红色毛癣菌特异性引物扩增TRS－1区重复序列进行种内基因分型,并分析检测结果与感染部位的相关性。结果: 138株红色毛癣菌共分离出3种菌落表型:绒毛型、沟纹型和粉末型；分离出5型基因型,其中Type1 64株,Type2 18株,Type3 19株,Type4 12株,Type5 25株。红色毛癣菌的表型和基因型与感染部位均无相关性(均P＞0.05),红色毛癣菌的菌落表型与基因型有一定的相关性(P＜0.05)。结论: 红色毛癣菌基因型与菌株来源有关而与感染部位无关,可为判断复发和再感染提供依据。

红色毛癣菌； 菌落表型； 基因型

红色毛癣菌在PDA培养基上可分出不同的菌落形态,按传统方法可分为5型:羊毛型、绒毛型、沟纹型、粉末型和颗粒型,由于羊毛型和绒毛型不易区分,所以本文将红色毛癣菌的表型分为绒毛型、沟纹型、粉末型和颗粒型。红色毛癣菌的基因分型方法很多,但种内特异性不高,本文利用红色毛癣菌特异性引物,扩增TRS－1区的重复串联序列得到5种基因型,并进一步探讨表型与基因型的关系,以及两者与感染部位的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 受试菌株来自中国医学科学院皮肤病研究所真菌科。其中手足癣77株,体股癣26株,甲癣35株。实验所用红色毛癣菌(菌号T1a)和须癣毛癣菌(菌号T5b)标准菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。

1.2 菌种鉴定 采用玻片小培养,红色毛癣菌镜下见棒状大分生孢子和泪滴状小分生孢子。毛发穿孔试验阴性以及尿素酶试验阴性。

1.3 试剂及仪器 DNA提取及电泳试剂由南京生兴生物技术有限公司提供,Taq酶、引物及DNA marker由上海生物工程有限公司提供。DNA扩增仪为BIORAD公司生产。

1.4 表型分型 将菌株用点种法接种到PDA平皿上,置28℃恒温箱孵育10 d,体视显微镜下观察菌落形态。

1.5 基因分型 采用冻融法提取DNA,1.5%的琼脂糖凝胶电泳结果,判断提取率。以TrNTSF－2(5'－ACCGTATTAAGCTAGCGCTGC－3')、TrNTSR－4(5'－TGCCACTTCGATTAGGAGGC－3')为引物扩增TRS－1区的重复串联序列,TRS－1区PCR反应条件:94℃预变性4 min,94℃变性45 s,55℃退火30 s,74℃延伸2 min,30个循环,最后74℃延伸10 min。PCR反应产物的检测:1.5%琼脂糖凝胶电泳后,凝胶程序系统观察结果并采集图像。

1.6 统计学方法 应用SPSS 13.0统计分析软件进行数据分析。

2 结果

2.1 表型与感染部位的相关性 138株红色毛癣菌在PDA培养基上分出3种表型:粉末型、沟纹型和绒毛型(图1)。其中粉末型26株,沟纹型16株,绒毛型96株,表型与感染部位经卡方检验无相关性(χ2＝5.32,P＞0.05),见表1。

图1 红色毛癣菌的菌落形态

表1 红色毛癣菌表型与感染部位的关系

2.2 表型与基因型的相关性 采用红色毛癣菌特异性引物扩增TRS－1区的重复串联序列,根据条带不同可分为5型。Type 1为单条带,400 bp,Type2为600 bp单带或600 bp、400 bp两带,Type 3为800 bp、600 bp、400 bp 3带,Type 4为1000 bp、800 bp、600 bp和400 bp 4带,其余带型较少见,不再细分,统归为Type 5,200 bp×n不定。本文138株红色毛癣菌分出5种带型,Type1 64株,Type2 18株,Type 3 19株, Type4 12株,Type5 25株(图2)。基因型与感染部位无相关性(χ2＝9.56,P＞0.05),见表2。表型与基因型经卡方检验有一定的相关性(χ2＝21.18,P＜0.05),见表3。

图2 本实验中TRS－1扩增基因型

表2 红色毛癣菌基因型与感染部位的关系

表3 红色毛癣菌表型与基因型的关系

3 讨论

本研究中我们共收集了138株红色毛癣菌临床株,其中手足癣77株,甲癣35株,体股癣26株,采用传统的表型分型方法,将其分为绒毛型(96株)、沟纹型(16株)和粉末型(26),其中绒毛型致病率最高。红色毛癣菌基因分型方法有很多,Jackson等1报道了红色毛癣菌NTS区的两个高变区:TRS－1区和TRS－2区。TRS－2区变异小,条带单一,因此我们选用扩增TRS－1区来进行种内分型,分为5种带型:Type1占46.4%,Type2占13.0%,Type3占13.8%,Type4占8.7%,Type5占18.1%。与Jackson等1和Santos等2的分型结果相近。何晓丹等3也通过几种方法的比较发现TRS－l区PCR指纹图谱最适合用于红毛种内分型。Hryncewicz等4通过TRS和RAPD两种分型方法比较,发现前者的可重复性更好。

杨国玲等5用探针与DNA印迹法研究红色毛癣菌的基因分型,发现它们与传统的菌落表型有一定的关系,由于试验菌株数较少,与临床发病部位和菌株来源地区的关系尚不能得出确切的结论。成晓茹等6用RAPD法分析红色毛癣菌基因型,并与传统的表型分型相比较,未发现基因型与表型的对应关系。实验中我们比较了不同部位菌株的带型分布,发现红色毛癣菌菌株TRS－1区分型与菌株的感染部位无明显相关性。樊建峰等7用该法对不同部位菌株进行基因分型得出了与本研究相同的结论。

红色毛癣菌经传代后表型具有不稳定性,杨国玲等8发现红色毛癣菌菌株在20代传代过程中发生多次表型变异,且变异可逆转,同一菌株的原代与20代PCR扩增指纹图一致,基因序列亦基本一致。Baeza等9分析红色毛癣菌基因型与流行病学的关系时发现,有关联的临床菌株其基因型有高度的相似性,来自同一家孤儿院的分离株基因型相似系数＞90%,根据Chong等10观点可认为这些感染菌株可能由单一菌株进化而来。占萍等11在进行两足一手型手足癣病例分析时发现80%以上的患者手足部位菌株基因型相同,进一步说明了红色毛癣菌基因型与菌株来源有关而与感染部位无关。

本研究的不足之处是未进行TRS－2区分型,尽管此区只能分出两种带型,但是如果TRS－1区和TRS－2区分型相结合可将红色毛癣菌分出更多的带型,能更清楚的确定传染来源,区分复发和再传染。

1 Jackson CJ,Barton RC,Kelly SL,et al.Strain identification of Trichophyton rubrum by specific amplification of subrepeat elements in the ribosomal DNA nontranscribed spacer.Clin Microbiol,2000,38(12):4527－4534.

2 de Assis Santos D,de Carvalho Araújo RA,Kohler LM,et al. Molecular typing and antifungal susceptibility of Trichophyton rubrum isolates from patientswith onychomycosis pre－and posttreatment.Int JAntimicrob Agents,2007,29(5):563－569.

3何晓丹,冉玉平,代亚玲,等.家庭内红色毛癣菌病患者间菌株差异性分析.中国真菌学杂志,2010,5(1):5－8.

4 Hryncewicz－Gwóz'dz'A,Jagielski T,Sadakierska－Chudy A,et al.Molecular typing of Trichophyton rubrum clinical isolates from Poland.Mycoses,2011,54(6):e726－736.

5杨国玲,李乔,于晓虹,等.红色毛癣菌基因型与表型的研究.中华皮肤科杂志,2003,36(12):682－684.

6成晓茹,吴爱军,张建秀,等.红色毛癣菌随机扩增DNA多态性分型研究.中华皮肤科杂志,2001,34(6):448－449.

7樊建峰,李恒进,索继江,等.红色毛癣菌种内分型.军医进修学院学报,2004,25(3):225－226.

8杨国玲,杜迎春,张明莉,等.传代对红色毛癣菌表型和核糖体基因影响的研究.中国皮肤性病学杂志,2007,21(5):263－266.

9Baeza LC,Matsumoto MT,Almeida AM,etal.Strain differentiation of Trichophyton rubrum by randomly amplified polymorphic DNA and analysis of rDNA nontranscribed spacer.JMed Microbiol,2006,55(4):429－436.

10 Chong PP,Lee YL,Tan BC,et al.Genetic relatednessof Candida strains isolated from women with vaginal candidiasis in Malaysia.JMed Microbiol,2003,52(8):657－666.

11占萍,吕雪莲,佘晓东,等.两足一手型手足癣致病菌种红色毛癣菌的基因型分析.中国皮肤性病学杂志,2009,23(1):3－5.

(收稿:2013－08－06 修回:2013－09－15)

A study on colony phenotyping and genotyping of Trichophyton rubrum

YANWei,ZHAN Ping,CHENWei,et al.Institute of Dermatology,Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing,210042

Objective:To determ ine the characteristics of colony phenotyping and genetyping of Trichophyton rubrum and the relationship with infection sites.Methods:Using the traditional cultivationmethod to discriminate the colony phenotypes of 138 stains of Trichophyton rubrum and typed by PCR amp lification of tandermly repetive elements(TRSs)TRS－1 from the ribosomal DNA nontranscribed spacer region(NTS).The results of the tests and the infection sites were analyzed.Results:The colonies of 138 Trichophyton rubrum were classified into three types,including downy type,furrowed type and powdery type,and 5 genotypes(the number of the genotypes 1,2,3,4,5 was 64,18,19,12,25).The colony morphology of Trichopyton rubrum wasno related with infection sites(P＞0.05).Therewasno significant difference between infection sites and genotypes(P＞0.05).The conoly phenotype was correlated with genotype(P＜0.05).Conclusion:Genotype and colony phenotype of Trichopyton rubrum were correlated and can be used in differential diagnosis of new infection and relapse.

Trichopyton rubrum；colony phenotyping；genotyping

1中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所,江苏南京,210042

2江西省皮肤病专科医院,南昌,350001

∗通信作者