HO－1对银屑病患者外周血单一核细胞TNF－α和IL－10生成的影响

马良娟宋 颖姚军英柏冰雪∗

HO－1对银屑病患者外周血单一核细胞TNF－α和IL－10生成的影响

马良娟1宋 颖2姚军英1柏冰雪1∗

目的: 确定血红素氧合酶同工酶1(HO－1)对银屑病患者外周血单一核细胞(PBMC)TNF－α和IL－10分泌的影响。方法: 分离培养PBMC,应用免疫印迹法检测PBMC中HO－1的表达,用ELISA法检测上清中TNF－α和IL－10水平。结果: CoPP(HO－1特异性诱导剂－钴原卟啉)可诱导健康者和银屑病患者PBMC表达HO－1蛋白,表达量随CoPP浓度的增加而增加。4种不同浓度CoPP所诱导的HO－1均可抑制TNF－α的分泌和增强IL－10的分泌,其抑制和增强作用均在CoPP 10μmol/L浓度下达高峰。结论: HO－1可调节银屑病患者PBMC TNF－α和IL－10的分泌,从而可能对银屑病起到抗炎和免疫调节作用。

银屑病； 血红素氧合酶－1； 外周血单一核细胞； 肿瘤坏死因子α； 白细胞介素10

银屑病是一种常见的慢性自身免疫性皮肤病,炎症细胞因子如TNF－α,IL－10等与银屑病的发生与发展有密切的关系。血红素氧合酶(HO)－1是催化血红素氧化降解过程中的关键酶,研究表明HO－1具有细胞保护、抗氧化、抗炎症反应、抗增殖和免疫抑制的作用。我们前期通过在银屑病动物模型中诱导HO－1表达上调,发现HO－1的诱导对银屑病样皮损有治疗作用并可影响动物血清中TNF－α、IL－10分泌。1,2本研究拟通过研究HO－1对银屑病患者外周血单一核细胞产生的TNF－α、IL－10的影响,探讨HO－1抗银屑病的机制并为其可能的临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料 寻常型银屑病患者20例均来自本科门诊和病房,并经临床和病理确诊,均为进行期,其中男13例,女7例,年龄18～52岁,平均34.6岁,病程3天～18年。所有患者均无其他自身免疫性疾病及合并症,受试前临床检查未发现急性期感染征象,3个月内未系统应用糖皮质激素、维A酸类和免疫抑制剂等,3个月内未外用糖皮质激素制剂,不伴明显的肝肾功能异常。正常人10例来自健康献血者,男6例,女4例,年龄19～46岁,平均33.7岁。该研究经过医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 淋巴细胞分离液Ficoll购自上海华精生物高科技有限公司,RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司,新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,HO－1特异性诱导剂－钴原卟啉(CoPP)购自美国Sigma公司,人TNF－αELISA试剂盒、IL－10 ELISA试剂盒为深圳达科为生物技术有限公司进口分装。

1.3 外周血PBMC分离 取患者与正常人静脉血10 mL,肝素抗凝,常规Ficoll密度梯度离心法分离PBMC,台盼蓝检测细胞活力＞95%,用RPMI 1640配成1 ×106/m L细胞悬液。

1.4 外周血PBMC培养 正常人和银屑病患者的PBMC进行24孔板培养,再分别分为5组:对照组, CoPP5组,CoPP10组,CoPP20组和CoPP50组。对照组加2 m L的细胞悬液,余4组每孔分别加1μmol/ mL CoPP 10μL、20μL、40μL、100μL,最后每孔加细胞悬液至总体积2 m L。CoPP的终浓度分别为5 μmol/L(CoPP5组)、10μmol/L(CoPP10组)、20 μmol/L(CoPP20组)和50μmol/L(CoPP50组)。37℃5%CO2饱和湿度培养48 h,离心后收集上清液,－20℃冻存,用于细胞因子的检测,收集细胞置－80℃保存,用于Western Blot检测。

1.5 Western Blot方法检测PBMC中HO－1蛋白 应用RIPA蛋白裂解液从PBMC中提取蛋白质,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,电转膜法将蛋白转移到硝酸纤维膜上,用5%脱脂奶粉封闭,加入β－actin和HO－1 mAb(1∶500), 4℃孵育过夜,洗膜,然后加入1∶500稀释的碱性磷酸酶标记二抗,加DAB显色。以Bio－Rad凝胶成像系统照相、测定条带的光密度,计算目标蛋白和β－actin蛋白之间光密度(谱带面积与光密度乘积)比值,每组样本重复4次。

1.6 ELISA法检测细胞因子TNF－α、IL－10 按照ELISA试剂盒说明书进行操作,倍比稀释标准品,绘制标准曲线,从中求得培养上清中细胞因子的含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析,方差齐性检验采用Levene检验,两样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用方差分析和t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC中HO－1蛋白的表达 见图1、2。在正常人组,对照组PBMC中HO－1几乎无表达,而在4个CoPP处理组,HO－1蛋白表达明显增高。在银屑病组,对照组PBMC中HO－1蛋白轻度表达,而在4个CoPP处理组HO－1蛋白显著增高。无论是正常人还是银屑病患者,PBMC中HO－1的表达量随着CoPP剂量的增加而增加。

图1 正常人PBMC中HO－1蛋白的表达

图2 银屑病患者PBMC中HO－1蛋白的表达

2.2 ELISA法检测HO－1对PBMC分泌TNF－α的影响 见表1。与对照组比较,CoPP在4种浓度下所诱导的HO－1均可抑制TNF－α的分泌(P＜0.05),但CoPP 10μmol/L组与CoPP 5μmol/L组间差异有显著性(P＜0.05),CoPP 10μmol/L组与20μmol/L组和50μmol/L组间则无显著性差异(P＞0.05),说明在CoPP浓度为10μmol/L时所诱导的HO－1对TNF－α的抑制作用达到高峰,HO－1的进一步增加不会对TNF－α有更显著的影响。

表1 HO－1对银屑病患者和正常人PBMC产生TNF－α、IL－10的影响

2.3 ELISA法检测HO－1对PBMC分泌IL－10的影响 见表1。与对照组比较,CoPP在4种浓度下所诱导的HO－1均可增强IL－10的分泌(P＜0.05),同样在CoPP浓度为10μmol/L时作用达到高峰。

3 讨论

TNF－α是巨噬细胞受到刺激而释放的细胞因子,研究表明银屑病皮损中存在着TNF－α的过量表达,且随病情的好转,表达量相应下降。目前TNF－α拮抗剂已经成功的应用于临床,成为治疗严重银屑病的新型生物制剂。3IL－10是一种具有负向调节免疫功能的细胞因子,可抑制Th1细胞增殖与IL－2、IFN－γ等细胞因子分泌。有研究报道银屑病患者在治疗前血清IL－10水平明显降低,经治疗后外周血单核细胞中IL－10 mRNA水平升高。4Lee等5报道,银屑病患者全血IL－10表达水平较健康对照降低。

HO－1催化血红素氧化降解为铁离子、CO和胆绿素。HO－1是HO的可诱导型,通过血红素的代谢产物而发挥作用。研究表明在许多病理生理状态下, HO－1具有细胞保护、抗氧化、抗炎症反应、抗增殖、抗凋亡和免疫抑制的作用。6－9我们前期在检测银屑病患者与正常人PBMC HO－1 mRNA和免疫组化检测HO－1蛋白的实验中未见明显差异。10本研究中发现银屑病患者组PBMC中HO－1蛋白的表达略高于正常对照组。

银屑病患者TNF－α的分泌量均高于对照组,IL－10的分泌量相对低于对照组,这与以往的相关研究结果一致；不同浓度的CoPP诱导的HO－1均可抑制TNF－α的分泌,诱导IL－10的产生,这与我们前期在动物模型中的研究结果一致。2有研究报道在巨噬细胞和树突状细胞中HO－1可减少TNF－α的分泌和增强的IL－10的的分泌,11而且HO－1缺陷的小鼠脾细胞TNF－α分泌显著增加,12提示HO－1可能介导了抗炎反应。其作用可能与HO－1催化血红素氧合酶代谢所释放的CO有关,CO可通过p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化作用抑制LPS激活的巨噬细胞TNF－α和IL－1β分泌而增加IL－10的分泌。13

本研究发现,无论是正常人还是银屑病患者,不同浓度的CoPP均可诱导HO－1的表达,且表达强度与CoPP浓度呈剂量依赖关系。CoPP所诱导的HO－1对TNF－α和IL－10的影响在其浓度为10μmol/L时达到高峰,继续增加CoPP的浓度虽然可使HO－1的表达量增多,但对TNF－α和IL－10的影响却不显著,也许在此浓度以后随浓度的增加,HO－1的作用逐渐减弱,对此有待进一步研究。

本研究提示HO－1能够调节银屑病患者TNF－α和IL－10的分泌,从而对银屑病可能起到抗炎和免疫调节作用,相信随着对HO－1作用机制的深入研究,有望为银屑病治疗提供一种新途径。

1Ma LJ,You Y,Bai BX,et al.Therapeutic effects of heme oxygenase－1 on psoriasiform skin lesions in guinea pigs.Arch Dermatol Res,2009,301(6):459－466.

2马良娟,宋颖.血红素氧合酶－1豚鼠银屑病样模型外周血中TNF－α和IL－10的影响.中国皮肤性病学杂志,2011,25(6): 411－414.

3 Takahashi H,Tsuji H,Hashimoto Y,et al.Serum cytokines and growth factor levels in Japanese patientswith psoriasis.Clin Exp Dermatol,2010,35(6):645－649.

4 Niu X,Cao W,Ma H,et al.Acitretin exerted a greater influence on T－helper(Th)1 and Th17 than on Th2 cells in treatment of psoriasis vulgaris.JDermatol,2012,39(11):916－921.

5 Lee YH,Choi SJ,Ji JD,et al.Associations between interleukin－10 polymorphisms and susceptibility to psoriasis:ameta－analysis.Inflamm Res,2012,61(7):657－663.

6Agarwal A,Bolisetty S.Adaptive responses to tissue injury:role of heme oxygenase－1.Trans Am Clin Climatol Assoc,2013,124: 111－122.

7 Neubauer JA,Sunderram J.Heme oxygenase－1 and chronic hypoxia.Respir Physiol Neurobiol,2012,184(2):178－85.

8 Kirino M,Kirino Y,Takeno M,et al.Heme oxygenase 1 attenuates the development of atopic dermatitis－like lesions in mice: implications for human disease.J Allergy Clin Immunol,2008, 122(2):290－297.

9Pae HO,Ae Ha Y,Chai KY,etal.Heme oxygenase－1 attenuates contact hypersensitivity induced by 2,4－dinitrofluorobenzene in mice.Immunopharmacol Immunotoxicol,2008,30 (2):207－216.

10马良娟,宋颖,姚军英,等.HO－1在银屑病患者皮损及外周血单一核细胞中的表达.中国麻风皮肤病杂志,2013,29 (7):440－442.

11 Chauveau C,Remy S,Royer PJ,et al.Heme oxygenase－1 expression inhibits dendritic cellmaturation and pro－inflammatory function but conserves IL－10 expression.Blood,2005,106 (5):1694－1702.

12Kapturczak MH,Wasserfall C,Brusko T,etal.Heme oxygenase－1 modulates early inflammatory responses:evidence from the heme oxygenase－1－deficientmouse.Am J Pathol,2004, 165(3):1045－1053.

13Otterbein LE,Bach FH,Alam J,et al.Carbon monoxide has anti－inflammatory effects involving the mitogen－activated protein kinase pathway.Nat Med,2000,6(4):422－428.

(收稿:2013－08－19 修回:2013－09－26)

Im paction of hemeoxygenase－1 on the production of TNF－αand IL－10 in peripheral blood mononuclear cells of patients w ith psoriasis

MA Liang-juan,SONG Ying,YAO Jun-ying,et al.Department ofDermatology,The Second Affiliated Hospital ofHarbin Medical University,Harbin,150081

Objective:To investigate the effects of hemeoxygenase－1(HO－1)on the production of TNF－αand IL－10 by peripheral blood mononuclear cell(PBMC)in the patientswith psoriasis vulgaris.Methods: PBMCswere obtained and cultured.The expression of HO－1 protein was tested byWestern－blot.The level of TNF－αand IL－10 in the supernatants of cultured PBMC wasmeasured by a specific enzyme－linked immunosorbent assay.Results:CoPP induced the expression of HO－1 protein in PBMC of both patients and controls in a dose－dependentmanner.The secretion of HO－1 protein induced by different concentration of CoPP inhibited the secretion levels of TNF－αand enhanced the secretion of IL－10,and themaximum effective concentration was 10μmol/L.Conclusion:HO－1 can be induced from the secretion of TNF－αand IL－10 PBMC in patientswith psoriasis vulgaris,thus it is possible thatHO－1may be played in a role of anti－inflammatory and immunomodulatory function in psoriasis.

psoriasis；HO－1；PBMC；TNF－α；IL－10

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(编号:12511186)黑龙江省卫生厅科研课题(编号:2010－063)

1哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科,150081 2黑龙江省医院皮肤科,哈尔滨,150036∗通信作者