HIF—1α与口腔白斑癌变的相关性研究

罗霞　周景喜　陈华志

[摘要] 目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在口腔白斑血管生成中的作用及其与口腔白斑术后复发的相关性与影响因素。 方法 免疫组化法检测口腔鳞状细胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜中HIF-1α的表达情况，荧光定量PCR法检测microRNA表达。 结果 与口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相对表达量显著增加，而口腔鳞癌与口腔白斑相比，microRNA相对表达量显著增加，两两比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 HIF-1α在口腔白斑及白斑癌组织中过度表达，其可作为判断口腔黏膜组织发生白斑病变及白斑癌变的标志物之一。

[关键词] 缺氧诱导因子-1α；口腔白斑；血管生成

[中图分类号] R739.8 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）05-0028-03

我国口腔颌面部鳞状细胞癌多发于40～60岁的成年人，早期发现是目前预防与治疗鳞癌的最佳方法，通过HIF-1α与口腔白斑癌变的相关性研究可以早期判断白斑的性质。口腔黏膜白斑是口腔黏膜病中常见的一种疾病，国内外一直有大量学者在研究两者的关系，探讨HIF-1α在口腔黏膜白斑可能的相关发病机制，为口腔黏膜白斑的诊断、治疗和预后判断提供实验依据[1]。本研究将采用免疫组化法测定口腔白斑组织中HIF-1α表达情况，并对其与口腔白斑发生及发展相关性进行分析，旨在为临床口腔白斑的治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2005～2012年从本院病理科选取的口腔鳞状细胞癌、口腔白斑及口腔正常黏膜石蜡切片标本各15例，三组病理组织学标本结果均由两位资深的病理分析医师共同确认。每个样本均采用连续切片法，样本的厚度为4 μm，具体资料见表1。

表1 实验样本基本资料

1.2 方法

1.2.1 microRNA含量的测定 采用RT-PCR（购于美国ADI公司）测定各组组织中microRNA含量，设计针对人microRNA的PCR探针序列以及荧光检测引物，选择人GAPDH（由美国BD公司提供）作为测试的内参物，并采用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）提取RNA，荧光定量PCR实验严格按照试剂盒操作说明进行。microRNA相对表达量=目的基因/内参基因。

1.2.2 免疫组化法测定 采用免疫荧光组化法检测两组HIF-1α、VEGF表达情况，兔抗人VEGF多克隆抗体购于福州迈新生物技术公司，HIF-1α鼠抗人多克隆抗体购于北京金桥生物技术公司。HIF-1α采用EDTA热修复处理20 min，VEGF采用柠檬酸缓冲液于高压锅中热修复处理2 min后采用冷水洗涤，并采用PBS缓冲液对样品进行冲洗，经苏木精复染后采用乙醇对样本脱水并制成中性树胶封片，并与已知的阳性切片进行对比，阴性对照采用PBS缓冲液替代一抗的样本为参照。

1.3 免疫组化结果判断

①HIF-1α阳性表达为棕黄色颗粒见于细胞核内，VEGF阳性表达为棕黄色颗粒见于细胞质及细胞核内。②在倍数为100的显微镜下观察细胞着色情况，根据着色程度由轻至重可分别计为0、1、2、3分。随机选取5个视野点，采用倍数为400的显微镜进行观察，每个视野进行细胞计数，以500个细胞作为一组计算单位，细胞阳性百分率：1分为<10%，2分为10%～50%，3分为>50%。积分计算：①与②计算所得的分值相乘。0分为阴性“-”，1～3分为弱阳性“+”，4～6分为中度阳性“++”，7～9分为强阳性“+++”[3]。

1.4 统计学分析

应用SPSS17.0软件进行统计学分析，计数资料用相对数表示，组间比较采用χ2检验，HIF-1α与VEGF相关性采用Spearman相关分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 microRNA的相对表达量分析

与口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相对表达量显著增加，而口腔鳞癌与口腔白斑相比，microRNA相对表达量显著增加，两两比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 HIF-1α与VEGF阳性表达情况

正常黏膜、口腔白斑、口腔鳞癌中HIF-1α阳性表达率分别为0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鳞癌中VEGF阳性表达率分别为0、66.70%、100.00%。见表3。

表3 HIF-1α与VEGF阳性表达情况

注：与对正常黏膜相比，口腔白斑χ2=5.487，aP < 0.05；与口腔白斑相比，χ2=4.212，bP < 0.05

2.3 microRNA与HIF-1α、VEGF相关性分析

经相关性分析可知，microRNA与HIF-1α表达呈负相关（r=-0.452，P=0.000），與VEGF蛋白呈正相关（r=0.378，P=0.000）。

3 讨论

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔科中常见的恶性肿瘤，其临床发生率约占全身恶性肿瘤发生率的3%～5%，约占口腔恶性肿瘤发生率的90%以上[2]。OSCC在我国是口腔颌面部中常见的恶性肿瘤，其临床表现为早期淋巴结转移、局部浸润性强、预后差等特点，且该疾病容易转化为萎缩型、长期糜烂型以及溃疡型[3]。由于OSCC属于上皮源性肿瘤，因此其发生经历了与其他上皮细胞组织癌的发展过程相同，其发展过程经历了正常细胞到癌前病变最后发展成为转移性癌症等系列动态过程，其参与过程复杂、属于多阶段发生的过程，其病变过程是受到多种基因调控来完成。

目前普遍认为，口腔白斑复发是由于内外因素共同作用引起的，血管生成是肿瘤发展的首要条件[4]。李德超等[5]认为，肿瘤周围微环境中抑制因子及促进因子调控失衡是导致肿瘤血管生成的重要因素。VEGF是血管内皮细胞有丝分裂素，属于重要的血管生成促进因子，其在血管生成过程中处于核心地位[6]。大量研究表明[7]，在正常成年人群中VEGF的表达水平非常低，而在恶性肿瘤患者中VEGF表达水平异常高。此外，VEGF可诱导血管、淋巴管内皮细胞迁移及增殖，促使淋巴血管及生成，并可增加淋巴血管通透性，加速淋巴血管转移，因此与肿瘤恶性程度具有密切的关系。肿瘤患者体内普遍存在免疫识别障碍的情况，机体在此情况下可将肿瘤组织误认为自身组织，从而产生应激反应，并诱导HIF-1α生成。HIF-1α表达增强可刺激肿瘤蛋白及基因转录，并促使VEGF大量生成。目前相关研究[8]表明，HIF-1α与肿瘤的发生发展具有密切的关系，在肿瘤发生发展过程中起到重要的调控作用。蔡劲等[9]研究指出，HIF-1α表达强度与癌症患者总体生存期及术后复发率显著相关，HIF-1α表达水平可作为，口腔白斑患者根治手术术后复发的预测指标。吴洋[10]对口腔白斑患者预后情况进行分析，其结果显示口腔白斑患者己糖激酶-Ⅱ及HIF-1α表达强度与肿瘤大小、分化程度、临床分期有密切关系，是影响患者术后预后的独立危险因素。

本研究结果显示，与口腔正常黏膜相比，口腔白斑microRNA相对表达量显著增加，而口腔鳞癌与口腔白斑相比，microRNA相对表达量显著增加，两两比较差异有统计学意义，经相关性分析可知，microRNA与HIF-1α表达呈负相关（r=-0.452，P=0.000），与VEGF蛋白呈正相关（r=0.378，P=0.000），从而提示HIF-1α阳性表达强度与患者生存率及生存期限具有密切的关系。正常黏膜、口腔白斑、口腔鳞癌中HIF-1α阳性表达率分别为0、73.30%、100.00%，而正常黏膜、口腔白斑、口腔鳞癌中VEGF阳性表达率分别为0、66.70%、100.00%，从而提示通过测定口腔白斑患者HIF-1α阳性表达情况，对预测患者病情进展具有重要的意义。HIF-1α在口腔白斑及白斑癌组织中过度表达，其可作为判断口腔黏膜组织发生白斑病变及白斑癌变的标志物之一。

[参考文献]

[1] 王霞，吴淑华，王培源，等. 口腔癌组织中HIF-1α的表达及其与肿瘤耐药蛋白表达关系的研究[J]. 实用口腔医学杂志，2011，27（5）：682-685.

[2] 王彦梅. HIF-1与口腔恶性肿瘤的研究进展[J]. 安徽医科大学学报，2012，47（1）：100-103.

[3] 李善昌，刘芷君. HIF-1α、MMP-9及PTEN在舌鳞癌组织中的表达及意义[J]. 口腔医学研究，2011，27（10）：896-898.

[4] 王淑红，张雄，张劲娥，等. 两个慢病毒真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1α的構建及检测[J]. 中华口腔医学杂志，2012，47（Z1）：244-247.

[5] 李德超，王健平，朱杨，等. 小干扰RNA干扰缺氧诱导因子-1α增强口腔鳞癌细胞株化疗敏感性[J]. 生物技术通讯，2012，23（1）：49-51.

[6] 张劲涛，林凯金，贾永峰，等. 缺氧诱导因子-1α对口腔鳞状细胞癌血管生成拟态相关基因影响的实验研究[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2012，6（19）：5814-5820.

[7] 高哲，南欣荣. HIF-1α和Glut-1在涎腺黏液表皮样癌中的表达和临床意义[J]. 实用口腔医学杂志，2011，27（5）：686-689.

[8] 阙林，康非吾，高吟，等. 低氧诱导下舌鳞癌SCC-6细胞中HIF-1α、VEGF的表达及TSA对其表达的抑制[J]. 口腔颌面外科杂志，2012，22（4）：242-246.

[9] 蔡劲，任大宏，杨静，等. 舌鳞癌组织中HIF-1α和VEGF表达及与肿瘤血管生成的关系[J]. 实用医学杂志，2013， 29（8）：1215-1218.

[10] 吴洋. HIF-1α/VEGF信号通路对口腔癌生物学行为影响及诊疗意义[J]. 中国实用口腔科杂志，2012，5（12）：713-720.

（收稿日期：2013-11-01）