梅毒螺旋体分子流行病学研究进展*

曾 丹 综述,周维康 审校

(重庆市第三人民医院过敏反应科 400014)

梅毒是由苍白螺旋体(treponema pallidum，TP)引起的慢性传染病，主要通过性交传染。近年来，世界各地梅毒发病率呈上升趋势，我国梅毒发患者数也快速增长，据报道，2010年全国报告梅毒病例358 534例，2010年发病率26.86/10万，比2009年增加17.02%，居全国乙类传染病的第3位。本病危害大，可侵犯皮肤黏膜、心血管、神经、骨骼等造成多系统损害,也可使妊娠期妇女发生流产、死胎和分娩先天梅毒儿。在性传播疾病中，梅毒致死性仅次于艾滋病，其与艾滋病的传播途径相似，同时，梅毒作为一种溃疡性性病，可大大增加感染HIV的风险，有报道称生殖器溃疡患者较健康人感染HIV的危险性增加4～5倍[1]，因此，梅毒的流行在客观上促进了HIV的传播，控制梅毒等相关的生殖器溃疡疾病，能有效控制HIV的传播和艾滋病的发生。目前，国内外学者也越来越重视梅毒螺旋体的研究。梅毒螺旋体分子亚型研究不仅与梅毒流行病学紧密相关，也可用于识别和分析梅毒的再感染。TP不能根据血清学方法进行区分，有学者曾通过DNA杂交及单核苷酸多态性等进行分型，未成功[2-3]。自从Fraser等[4]揭示了TP的基因序列后，有关TP的研究进入了分子生物学时代。

1 TP基因分型系统

1.1arp、tprEGJ双基因分型法(CDC分型系统) 最早进行TP基因分型研究的是美国CDC的Pillay等[5]，其于1998年《Sex Transm Dis》中报道了一种分型方法，选用两种显示株内变异的基因：酸性重复蛋白基因arp和TP重复序列tpr Ⅱ亚类(EGJ)作为分型基因，建立了TP基因的分型方法。将arp基因含有的60 bp(碱基对长度)相似重复序列的数目和tpr基因Mse1限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorohism,RFLP)的类型相结合。首先对arp基因进行普通PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分离，将得到的目的片段换算成60 bp重复序列的数目，并用相应的阿拉伯数字表示。目前已发现arp含有2～22个60 bp重复基因序列，共21个亚型。Harper 等[6]的分子流行病学研究结果显示在不同的人群、不同的临床病程中,该重复序列的出现次数均存在显著性差异。同时tpr基因进行套式PCR扩增，产物先后经Mse1限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，最后产生不同电泳条带的样式即为RFLP类型，依次用英文字母表示。根据不同株出现长度不等的限制性内切酶的酶切片段，已发现tpr基因A-L共12个亚型。最后将两个结果相结合即为TP基因型别,例如TP Nichols株属于14a亚型。通过兔传代并经组织培养的TP Nichols株进行验证的结果和采用Simpson多样性指数分析的结果均显示，该分型方法具有结果稳定、分辨率高和可重复性好的特点，容易操作，而且对TP株有很高的鉴别力，符合一般微生物分型系统的评判标准。

1.2arp、tpr/tp0548三基因分型法 最近，Marra等[7]在上述分型系统的基础上引入了tp0548基因，进一步提高了基因分析的区分能力。同样的，是将arp基因含有的60 bp相似重复序列的数目和tpr基因Mse1 RFLP的类型相结合，再加上tp0548的基因分析。研究发现，从起始密码子起，部分基因131 bp的下游侧有变异，观察到tp0548基因有9个不同的序列组，这些序列组用小写英文字母a-i表示。将改进了的分型系统表示为“CDC subtype/tp0548 sequence type”，例如：14d/f。这种分型系统被描述为“改良梅毒螺旋体菌株分型系统”，在接下来的研究中发现了这种分型系统具有生物学与临床学的关联性。通过对TP Nichols株与原始株的无性繁殖，然后进行分型比较，结果二者的分型一致(14a/a)，提示该分型具有稳定性的特点。国内学者彭锐锐等[8]运用了三基因定位分型方法检测梅毒螺旋体基因型别的敏感性与特异性，分析arp基因60个碱基对重复序列的数目、tprEGJ基因MseI酶切后限制性片段长度多态性的型别和tp0548基因序列的型别，根据上述三基因的分析结果，分析梅毒螺旋体基因型别。结果发现，临床标本中三个基因的扩增敏感性分别是94.1%、91.2%和94.1%；91.2%的临床标本检测出完整的基因型别，与二基因分型法相比，提高了6.2%的区分度。可以认为，改良的三基因分型方法检测梅毒螺旋体基因型别具有敏感性高、特异性好、区分度强的特点。

2 梅毒螺旋体基因分型的临床应用

2.1基因分型标本的选取 目前用于分型的标本主要考虑梅毒螺旋体的量，主要来源于早期梅毒的侵润性皮损，且主要是溃疡性皮损，也有脑脊液和全血。Martin等[9]认为，应用PCR技术检测一期梅毒患者体内梅毒螺旋体DNA最适合的标本是生殖器溃疡分泌物。一些研究者发现以血清为标本，阳性率高，另外有报道以血浆为样本，阳性率高[10-11]，而Orton等[12]称在全血中未能检测到梅毒螺旋体。Molepo等[13]在对梅毒患者脑脊液(CSF)标本进行分型分析时发现,性病研究实验室(VDRL)阳性的CSF标本,可能有足够的DNA以供分型研究，因为在所有可分型的标本中，仅一份标本其VDRL试验的IgG结果阴性，其余均为阳性。Castro等[11，14]研究发现耳垂血用于PCR检测的效率高于全血、血浆和血清,其原因可能是TP与包柔氏螺旋体相似,多隐藏于毛细血管床比较丰富的耳垂部。还有最近的一项研究，Wu等[15]发现，TP DNA分离率最高的是溃疡分泌物，接下来依次是血浆、血清、脑脊液和玻璃体液。这些实验结果的差异可能是由于梅毒螺旋体DNA提取方法、PCR检测技术以及临床样品的质量和梅毒螺旋体含量等一些不避免的因素造成。另外，其他临床样本也可用于梅毒螺旋体的PCR技术检测，如二期梅毒疹渗出物、淋巴结穿刺液、羊水、组织抽吸物、石蜡包埋组织、精液、外周血单核细胞、胃黏膜组织、树胶肿等。

2.2梅毒螺旋体基因分型用于流行病学调查

2.2.1arp、tpr双基因分型法(CDC分型系统)的应用 梅毒螺旋体的arp基因和tpr基因的联合分型目前主要用于梅毒分子流行病学调查。Pillay等[5]首次应用这种分型方法,将在美国、马达加斯加和南非收集的46例样本分16个亚型,其中马达加斯加收集的21个样本有12个属于14d亚型,美国收集的13个样本只有3个属于14d亚型,从这可以反映出14d亚型在马达加斯加广泛流行。另有研究发现南非各地区的161例样本可分35个亚型,优势流行菌株亦14d亚型，研究人员推测,菌株高度的变异性可能是梅毒在南非长期流行的结果[16]。而在亚利桑那州、卡罗来纳州和美国北部,14F亚型是主要的流行株[16]。南非比勒陀利亚[13],研究者们从来源于晚期神经梅毒患者的标本中，确定了4种不同类型，分别是14A、2I、3E、17E，14A亚型是比勒陀利亚神经梅毒最主要的流行株,接下来为3E，并检出少见的亚型(2I和 17E),其中2I、3E、17E是在那之前的研究中所没有的，tpr中的e和i限制性片段长度多态性(RFLP)曾经报道过，但只有两个或三个60 bp重复序列的arp是首次报道。这个研究发现了4个亚型，提示没有某一亚型与神经梅毒的存在有独特的联系，所以进一步的研究是必要的，用以确定哪一种TP菌株类型与梅毒的不同临床表现有关联。葡萄牙里斯本的一项研究发现[17]，在同一患者所有样品中有相同的亚型，已经可以确定5种分子亚型(亚型10a、14a、14c、14f、14g),其中最常见的14a和最不常发现的10a，据研究表明，这是第一次确定10a亚型。而在苏格兰地区[18]，从来自白种男同性恋患者的75分标本中检测螺旋体DNA，一共确定了6种亚型(14b、14d、14e、14k、14j、14p)，最常见的为14d，接下来为14e、14j、14b、14p、14k，这一研究表明，14d在苏格兰地区占主导，同时，也表明了在苏格兰男同性恋有惊人的遗传多样性水平。而里斯本最常见的14a却没有在苏格兰地区发现，没有证据表明14d这一亚型与任何特定的患者、人口特征和地点有联系，但不能排除有相关特定流行病学、人口或危险因素的其他亚型。Cole等[19]在哥伦比亚做了一项关于二期梅毒的研究，用实时定量PCR确定了4种基因亚型，分别是14d、16d、13d和22a，同时这项实验第一次定量证实了有着显著比例的未经治疗的二期梅毒患者体内存在相当数量的循环螺旋体。至于TP是如何能长期存在于梅毒患者体内，还需要进一步的研究。在澳大利亚的一项男同性恋梅毒患者研究中[20]，确定了11种亚型(14e、14d、14k、14p、14i、14b、14l、12i、13b、13i、13e)。与其他地区比起来，澳大利亚的TP亚型没有明显的不同,最常见的是14e型。该试验也试图研究TP亚型与HIV感染、地域分布及梅毒不同临床表现的关系，遗憾的是，没有找到它们之间的任何联系。

2.2.2arp、tpEGJ/tp0548三基因分型法的应用 Marra等[7]在双基因分型的基础上率先尝试并且开创了三基因分型系统，来自美国、中国、爱尔兰、马达加斯加岛等的173份标本，用三基因分型法可以得到25种菌株类型，而二基因分型法只能得到14种，更重要的发现是，含有14个酸性重复蛋白基因的三个亚型(14a、14d、14e)可以进一步分离成单独的9个型别，亚型10d、11d、12a和15d也可以用三基因分型系统再进行细分，这证实了三基因分型法更好的基因区分能力，同时，该研究发现最常见的基因分型是14d/f、14d/g和15d/f。国内学者在《Sex Transm Infect》报道了我国TP的分型情况[21]，这项研究地区范围包括我国东部(南京)、南部(广州、江门、福州)、西南部(南宁、成都)、北部(天津)、东北部(哈尔滨)，一共确定了27种TP亚型，总的来说，我国TP亚型的分布在地理区域上有着显著的不同，但是以14d/f最为常见，接下来分别是15d/f、13d/f、16d/f、14a/f。虽然梅毒螺旋体在我国表现出遗传多样性，但是14d/f优势亚型可能暗含着梅毒跨地域传播的可能性。来自英国伦敦的学者Tipple等[22]在对抵抗大环内酯类抗生素的梅毒螺旋体研究中发现伦敦地区有两种亚型分布14d/g、14d/f，其中14d/g为主要的类型，而tp0548基因的g型可能与大环内酯抵抗有关。Wu等[15]也用三基因分型系统检测了136个梅毒患者，检测出来的亚型分别为14f/f、14f/c、14b/c、14k/f、9f/f、10b/a，其中最常见的为14f/f，而9f/f、10b/a是发现的新的基因型别，为首次报道，这些提示目前在台湾地区流行的梅毒螺旋体可能不同于美国和我国其他地区的型别。

综合世界各地的梅毒分型研究结果，梅毒亚型分布具有一定的特点，多个亚型或菌株型在同一地区共存和同一菌株在多地区出现的现象，表现出了遗传变异的复杂性及亚型分布的多样性。见表1。

表1 不同国家、地区梅毒亚型分布统计

续表1 不同国家、地区梅毒亚型分布统计

2.3分子亚型与临床联系 有研究发现，在兔模型中，不同的梅毒螺旋体菌株感染其病程和临床表现有所不同，某些菌株是神经梅毒的易感菌株，这些发现对梅毒的临床治疗具有重要的指导意义。相关研究提示，14 d/f可能与神经梅毒的易感性相关[7]，或者14d/f的TP菌株更能逃逸宿主免疫的应答。有学者研究发现[15]，感染14f/f的梅毒患者更可能表现出一期梅毒，可能的解释为14f/f可使溃疡表现的更明显或者持续的时间更长，使得患者和临床医师容易发现，还有种推测是14f/f型别的菌株在棉签拭子标本中或者在运输过程中能更好地适应环境而存活下来，而14f/f的二期梅毒患者在青霉素治疗的过程中更易发生吉海尔反应，至于导致这一现象的原因，尚不清楚。国外有专家认为，TP tpr基因家族是引起梅毒的主要的致病因子，是宿主体液免疫和细胞免疫的主要靶基因，这些蛋白可能在梅毒感染的免疫反应和保护性免疫中起着重要作用[23]。临床上部分梅毒患者出现“血清固定”现象，Giacani等[24]做梅毒血清固定与梅毒螺旋体tpr基因亚型关系的研究，发现血清固定的形成可能与TP tpr基因的i亚型相关。

3 展 望

虽然梅毒的有效治疗方法已在临床运用了几十年，但梅毒仍然是一个严重危害群众身心健康的重大公共健康问题。据世界卫生组织估计，全世界每年新发梅毒数可达1 200万例。分子流行病学被证明在预防和控制一定的传染性疾病方面是有用的，例如，结核分子杆菌的基因分型能将常规公共卫生调查所不能发现的患者确定出来，以脉冲凝胶电泳为基础的分子分型已能加强食源性疾病传染的监督，同样的，分子流行病学还是应该常规用于性传播疾病的预防和控制，虽然这些方法已用于淋病的研究[25]。梅毒分子亚型的研究将继续遵循：(1)新亚型的确定；(2)爆发株的检测；(3)鉴定各种特殊亚型之间的联系及其毒力和疾病的转归；(4)梅毒分子亚型的研究也将决定是否可消除地方特有的菌株水平的策略[18]。不像其他的性传播疾病，梅毒有较长的潜伏期，早期的临床表现不明显，所有的这些因素导致了其流行病学研究的困难，尽管有这些挑战，但TP分型系统已经能够解决一些问题，进一步的分子流行病学的研究和更好地方法有待于挖掘，从而能更好地服务于临床，解决梅毒患者之疾苦。

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