RP－HPLC法测定青蒿琥酯阿莫地喹片中主药的含量＊

胡志强，蒋 锋，姚 忠

（1.宜兴市人民医院，江苏宜兴 214200；2.江苏鹏鹞药业有限公司，江苏宜兴 214200）

青蒿琥酯阿莫地喹片，化学名为二氢青蒿素－10－α－丁二酸单酯，分子式是C19O8H28，为具有一定水溶性的青蒿素衍生物，对对传统药物产生抗药性的恶性疟疾有着很高的活性，临床上主要用于脑性疟疾与危重疟疾患者的抢救［1］。阿莫地喹为4－氨基喹啉衍生物，通过抑制裂殖体DNA复制与转录过程，而呈现强烈的抗疟作用，临床上主要用于已发作的疟疾，也可预防其发作，并可根治恶性疟疾；此外还可以用于阿米巴肝脓肿、肺吸虫病、肝吸虫病以及某些自身免疫性疾病［2－3］。目前，盐酸阿莫地喹与青蒿琥酯联合用药，是世界卫生组织（WHO）推荐的优质抗疟药。现行只有单方片的质量标准，采用UV法测定阿莫地喹的含量，该方法繁琐，且易受到辅料及其他杂质的干扰造成误差。为更好地控制产品质量，本文建立了RP－HPLC法测定青蒿琥酯和盐酸阿莫地喹片的含量，结果表明该方法简便、准确，专属性强，有助于更好地控制本品的质量；对方法进行了验证，为制定质量标准提供了依据。

1 仪器与试剂

Sartorius BT－25S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），岛津LC－20AT全自动液相色谱仪，PDA检测器，LC－Solution色谱工作站。

甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、高氯酸为分析纯，水为纯化水。青蒿琥酯盐酸阿莫地喹片3批样品和含量测定用对照品由江苏鹏鹞药业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 青蒿琥酯的含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（安捷伦，4.6mm×15cm，5μm）；流动相，乙腈—磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾1.36g，加水1 000 mL使溶解，用磷酸调pH至3.0）（体积比42∶58）；流速1.0mL／min；检测波长210nm；进样量20μL。

2.1.2 试验方法 供试品溶液的制备：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于青蒿琥酯50mg），置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声20 min，振摇，使青蒿琥酯溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取青蒿琥酯对照品约50 mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。

分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，以外标法计算含量。典型图谱如图1和图2所示。

图1 青蒿琥酯对照品溶液色谱图Fig.1 HPLC of artesunate RS

2.1.3 检测波长的选择 取青蒿琥酯对照品适量用甲醇溶解并稀释制成含青蒿琥酯1.0mg／mL的溶液。以PDA作为检测器，在200～400nm的波长范围内绘制紫外吸收曲线。本品越接近200nm吸收越强，故而选择210nm作为检测波长。

图2 青蒿琥酯供试品溶液色谱图Fig.2 HPLC of artesunate test solution

2.1.4 线性关系考察 取含量测定项下的青蒿琥酯对照品储备液，用流动相稀释成一系列质量浓度的溶液，浓度梯度分别为0.5，0.8，1.0，1.2，1.5和2.0mg／mL，按“2.1.1”项下色谱条件检测，以青蒿琥酯质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积为纵坐标（y），线性回归得标准曲线。结果表明，青蒿琥酯在0.500 5～2.002mg／mL质量浓度范围内，线性关系良好，线性回归方程为y＝608 125ρ－3 311.2，r＝0.999。

2.1.5 精密度试验 按“2.1.2”项下配制青蒿琥酯对照品溶液和供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图。以峰面积计算RSD为0.4%（n＝6），小于2.0%，符合要求。

2.1.6 回收率试验 取处方量的辅料空白9份，置50mL量瓶中，分别精密加入青蒿琥酯对照品40，50和60mg，各质量浓度平行3份，按“2.1.1”项下的色谱条件检测。样品中青蒿琥酯含量以外标法计算，得平均回收率为98.6%，RSD为0.6%（n＝9）。

2.1.7 定量限和检测限试验 取青蒿琥酯对照品溶液适量，用流动相逐级稀释，按“2.1.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图。按信噪比10∶1计算定量限，按信噪比3∶1计算检测限。青蒿琥酯定量限为14.1μg／mL，检测限为4.70μg／mL。

2.1.8 样品检测 取青蒿琥酯对照品溶液2份，色谱条件下各进3针，再取供试品溶液2份，色谱条件下进样，记录色谱图，按外标法计算含量，即得。本品3批青蒿琥酯含量结果分别为99.2%，99.3%和100.1%，符合规定。

2.2 阿莫地喹的含量

2.2.1 色谱条件 色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料（安捷伦，4.6mm×15cm，5μm）；流动相，甲醇—磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾13.6g，加水溶解并稀释成2 000mL，加高氯酸2.0mL，用磷酸调pH至2.5±0.5）（体积比22∶78）；流速1.0mL／min；检测波长224nm；进样量20μL。

2.2.2 试验方法 供试品溶液的制备：精密量取青蒿琥酯测定项下供试品溶液2mL置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取阿莫地喹对照品约10 mg，精密称定，置200mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。

分别精密量取阿莫地喹对照品溶液和供试品溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，以外标法计算含量。典型图谱如图3和图4所示。

图3 阿莫地喹对照品溶液色谱图Fig.3 HPLC of amodiaquine RS

图4 阿莫地喹供试品溶液色谱图Fig.4 HPLC of amodiaquine test solution

2.2.3 检测波长的选择 取阿莫地喹对照品适量用水溶解并稀释制成含阿莫地喹50μg／mL的溶液，以PDA作为检测器，在200～400nm的波长范围内绘制紫外吸收曲线。本品在224nm处有最大吸收，故而选择224nm作为检测波长。

2.2.4 线性关系考察 取含量测定项下的阿莫地喹对照品储备液，用水稀释成一系列质量浓度的溶液，浓度梯度分别为25，40，50，60，75和100μg／mL，按“2.2.1”项下色谱条件检测，以阿莫地喹质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积为纵坐标（y），线性回归得标准曲线。结果表明，阿莫地喹在25.03～100.1 μg／mL质量浓度范围内，线性关系良好，线性回归方程为y＝29 695ρ＋4 493.8，r＝0.999。

2.2.5 精密度试验 按“2.2.2”项下配制阿莫地喹对照品溶液和供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图。以峰面积计算RSD为0.4%（n＝6），小于2.0%，符合要求。

2.2.6 回收率试验 取处方量的辅料空白9份，置50mL量瓶中，分别精密加入阿莫地喹对照品40，50和60mg，各浓度平行3份，按“2.2.1”项下的色谱条件检测。样品中阿莫地喹含量以外标法计算，得平均回收率为99.5%，RSD为0.2%（n＝9）。

2.2.7 定量限和检测限试验 取阿莫地喹对照品溶液适量用流动相逐级稀释，按“2.2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图。按信噪比10∶1计算定量限，按信噪比3∶1计算检测限。阿莫地喹定量限为14.1μg／mL，检测限为4.70μg／mL。

2.2.8 样品检测 取阿莫地喹对照品溶液2份，色谱条件下各进3针，再取供试品溶液2份，色谱条件下进样，记录色谱图，按外标法计算含量，即得。本品3批阿莫地喹含量结果分别为98.7%，99.4%和99.6%，符合规定。

3 结论

本文采用反相高效液相色谱法测定青蒿琥酯和阿莫地喹的含量，生产时投料100%，3批中试产品含量结果在98.7%～100.1%之间，符合规定。方法学验证结果表明该方法简单、快捷、灵敏、准确，可有效测定本品含量。

［1］ 张洪，闫士君，张福明.高效液相色谱法测定青蒿琥酯的含量［J］.中国医院药学杂志，2012，32（1）：65－67.

［2］ 兰文，朱迎军，黄莉，等.RP－HPLC法测定盐酸阿莫地喹片的含量及有关物质［J］.中国药品标准，2013，14（1）：15－17.

［3］ 周于禄，刘世坤，张杰，等.高效液相色谱法测定人血浆中阿莫地喹含量［J］.中国医院药学杂志，2006，26（2）：704－706.

［4］ 周海钧.药品注册的国际技术要求（质量部分）［M］.北京：人民卫生出版社，2001：43.

［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）［M］.北京：化学工业出版社，2005：附录61－65.