辽东楤木根皮和人参茎叶总皂苷提取物对过度训练大鼠海马盐皮质类固醇受体MR，糖皮质激素受体GR蛋白表达的影响*

常 波，高珊珊，郭 琪，宋 洋，周丹丹，房 亮，李 腾

(1.沈阳体育学院运动人体科学学院，辽宁沈阳 110102;2.沈阳体育学院研究生部，辽宁 沈阳 110102)

随着竞技体育水平的不断提高，在追求最大应激反应的过程中有时会越过人体的生理极限，造成机体在一定时间内无法恢复的过度疲劳，它是一种病理性的改变，而非生理性的改变。不仅影响到正常的比赛和训练，还威胁到运动员的健康。而运动训练中如何科学训练，防止过度训练的发生，对于过度训练症候如何进行调理也是目前运动医学研究的热点问题。

本文探讨辽东楤木根皮醇提取物和人参茎叶总皂苷对过度训练大鼠海马盐皮质类固醇受体MR，糖皮质激素受体GR蛋白表达的影响，探讨过度疲劳发生的机制，寻找过度训练的防治的手段，为竞技体育服务。

1 实验对象与方法

1.1 实验对象

雄性Wistar大鼠77只，体重200g左右，按体重分层，随机分5组，常规分笼饲养，自由饮食水。大鼠每天上午均灌胃给药，药物由沈阳药科大学提供。各运动组大鼠每周运动6次，方式为递增负荷游泳，持续六周。具体试验分组及游泳给药情况见表1。

表1 大鼠分组及给药方案

表2 大鼠运动方案

大鼠在玻璃泳缸中游泳，大鼠运动方案见表2。在大鼠游泳过程中出现力竭时(力竭标准为大鼠从水面下沉，经10s后仍不能返回水面)，将其捞出，休息一定时间(5min～30min)后，放入泳缸中继续完成游泳负荷。

1.2 实验方法

1.2.1 血红蛋白的测定:采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定，按说明书进行测定。

1.2.2 尿素氮的测定:采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，用肝素抗凝的血清测定。按试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 尿总蛋白的测定::解放军总医院科技开发中心放免研究所试剂盒测定。

1.2.4 睾酮的测定:大鼠断头处死，取血后分离血清，置于－20℃冰箱保存。用放射免疫分析法测定血睾酮。采用深圳拉尔文生物工程有限公司提供的试剂盒(进口分装)，严格按说明书进行操作。

1.2.5 皮质酮的测定:大鼠断头处死，收集全血，肝素抗凝。皮质酮的提取用乙醇。采用Diagostic Products公司提供的试剂盒，严格按说明书进行操作。

1.2.6 Western Blot基本步骤

(1)样品(蛋白)的提取

①胞浆蛋白的提取:组织以1:5比例加入裂解缓冲液，200mg加1mlbuffer(20mmol/l TRIShcl Ph:7.5(0.1mmol/l Na3Vo4 25mmol/l NaF 2mmol/l EDTA EGTA 1mmol/l DTT，1mg/ml亮肽素/抑肽酶/，匀浆机匀浆，4度12000rpm离心1h，上清为浆蛋白组分。

②膜蛋白的提取:取上述沉淀加入膜蛋白提取液(含1%Triton)超声波粉碎(冰水中)4度过夜，4度12000rpm离心1h上清为膜蛋白。

③核蛋白的提取:利用差速离心法提取细胞核，加入核裂解液4度超声破碎，离心，4度12000rpm，1h，上清为核蛋白组分。

(2)电泳:根据分子量不同选择不同浓度的胶。

2 统计学处理

所获数据用SPSS10.0数据软件包进行处理，采用平均数±标准差(¯x±SD)表示，组间采用单因素方差分析判断总体显著性差异，显著性水平定在P＜0.05和P＜0.01。

3 实验结果

3.1 辽东楤木根皮醇提取物和人参茎叶总皂苷对6周递增负荷游泳训练后各组大鼠的一般观察及血、尿生化指标的变化

3.1.1 一般观察

从第四周开始，运动对照组大鼠运动能力下降，需要休息的时间也长，游后精疲力竭、喘息不止、掉毛现象严重，有的甚至是整块掉毛、毛色晦暗、体型瘦弱、神态疲惫、易受惊吓。而服药组大鼠掉毛现象不明显，毛色光亮，无明显的疲惫神态，游泳后很快能弄干身上的毛。

3.1.2 6周递增负荷游泳训练后各组大鼠血清睾酮(T)浓度、皮质酮(C)浓度、血清睾酮/皮质酮比值(T/C)、血红蛋白(Hb)、血清尿素氮(BUN)和尿蛋白(TP)含量的结果。

本实验对6周递增负荷游泳训练大鼠的一般情况、运动能力及血、尿生化指标的变化进行观察与测定，发现运动对照组大鼠一般情况差、运动能力降低、血清睾酮浓度和血红蛋白含量下降、血清皮质酮浓度、血清尿素氮和尿蛋白含量增高。结合有关过度训练判定标准的相关文献，综合分析认为运动对照组大鼠经6周递增负荷游泳训练后，大鼠已达到过度训练状态。

表3 6周递增负荷游泳训练后各组大鼠的血、尿生化指标

3.2 辽东楤木根皮醇提取物和人参茎叶总皂苷对过度训练大鼠海马MR，GR蛋白表达的影响

见表4，各组MR无显著差异。

与NC组相比较，EC组GR蛋白表达极显著下降，P＜0.01。

与EC组相比较，PG、LA和HA组GR蛋白表达显著升高(P＜0.01;P＜0.05;P＜0.05)。

与PG组相比较，LA和HA组GR蛋白表达明显下降(P＜0.05)。

表4 不同组别大鼠海马MR，GR蛋白的表达

图1 海马GR、MR的蛋白表达图谱

4 讨论

4.1 过度训练及过度疲劳训练模型的建立:

Lehman等也提出了过度训练的另一种诠释:即训练和恢复、运动与运动能力、应激与应激耐受力之间的失衡状态。过度训练所表现的各种症状称为过度训练症候群(overtraining syndrome，OTS)。其呈现高度的个体化特点，不同运动员之间的差别很大。根据不同运动员过度训练的表现可分为交感型过度训练症候群和副交感型过度训练症候群。

OTS常常是由于心理和生理混合因素造成的。它是多种现实生活应激刺激累积的结果，这些应激刺激包括:运动训练、睡眠不足、环境应激(热、冷、高海拔等)、职业压力及人际冲突等。焦虑的急剧增加与体力的疲劳一样，都可使一个人对应激耐受力下降。对比赛感情上的需求、胜利的渴望、失败的惧怕、不现实的高目标等都可能是无法忍受的心理应激之源。因此，典型的OTS一般都伴随着比赛欲望和训练热情的降低。

过度训练是继发于运动训练的应激反应，其生理机制尚不完全清楚。许多研究提示，过度训练与植物性神经紊乱、内分泌功能改变和免疫功能下降密切相关。

朱全与浦钧宗等用超负荷训练大鼠游泳的方法，建立了鼠模拟过度训练模型。大鼠随机分为3组:①对照组;②一般游泳训练组(NT)，进行中等强度游泳训练;③过度负荷组(OT)，即过度训练组，采用负重的方法增加游泳训练的强度，并在训练的后期，使训练动物反复运动至力竭。结果表明:过度负荷组大鼠在训练的后期，普遍出现了运动能力下降，血清睾酮浓度明显下降、皮质酮浓度明显升高，睾酮/皮质醇比值较对照组下降94.2%。

在本实验中发现，运动组大鼠经过6周递增负荷游泳后，普遍出现毛色等一般状况恶化和运动能力下降。末次运动24小时后血尿生化检查表明:运动组大鼠T、T/C比值和Hb较正常组分别下降73.94%，86.97%和20.14%，C较正常组升高97.73%，分别超过30%、30%、20%和20%的人类过度训练诊断参考标准。同时，运动组大鼠BUN和TP较正常组分别升高107.19%和202.69%。根据上述一般情况观察和血尿生化检查结果综合评定，结合朱全，郑陆等提出大鼠过度训练判断标准。以及冯炜权教授根据运动员在过度训练后血液和尿液中生化指标的变化提出了诊断过度训练的参考值［4］，这些指标反映了机体的代谢状况和运动能力，如血睾酮、血睾酮/皮质酮及血尿素氮反映了机体的代谢情况进行判定，大鼠经过6周递增负荷训练已经达到过度训练状态。

4.2 辽东楤木根皮醇提取物和人参茎叶总皂苷对过度训练大鼠海马MR，GR蛋白表达的影响

机体在接受或感知到环境或躯体变化(应激)时可以引起机体发生相应的行为和生理变化，包括自主神经活动改变如交感神经活动增强和神经内分泌活动改变，如下丘脑多个内分泌轴的激活，主要表现为交感－肾上腺髓质及HPA轴的功能增强。这是应激反应的最重要特征。HPA轴激活是机体对应激的最重要的适应性反应，GC的分泌有利于机体动员能量和保持内环境的稳定。然而，慢性应激有很多病理效应。大鼠研究结果表明，慢性应激可引起海马损害，其主要机制是长期高GC血症的神经毒性作用。

海马是边缘系统重要组成部分是HPA轴应激反应的高位调节中枢。正常情况下，海马可以抑制HPA轴的活性;在脑中，海马上GC受体表达最高，而对应激反应非常敏感且易损。在应激性海马损伤与血中，GC持续升高之间有着密切的互为因果的关系。

海马对HPA轴调节是通过其高密度皮质醇类激素受体MR及GR完成的，MR参与基础水平HPA轴的副反馈调节，它介导HPA轴基础活性的维持且与中枢应激反应阈值及敏感性有关。而GR还参与应激诱导的高水平GC的副反馈调节。应激状态MR/GR平衡失调使神经元处于易损状态，易于发生应激损伤疾患。

有研究表明，海马萎缩与衰老性神经元缺失有关，一些学者认为GC与兴奋性氨基酸(EAA)协同作用有关，并通过NMDA受体产生作用，GC与EAA协同损伤海马神经元。也有学者提出慢性应激运动时，EAA可能通过体内的Glu－NMDA受体－Ca2+－NO途径，引起海马组织的损害。另外，应激可以引起海马谷氨酸释放升高。慢性应激导致海马神经生长因子(NGF)mRNA表达降低。此外，GC引起海马神经元能量代谢紊乱及Ca2+失衡也可能是海马神经元损伤的原因之一。

我们的研究结果发现，各组海马盐皮质激素受体受体(MR)蛋白表达没有发生显著性变化，而过度训练组海马GR蛋白表达显著下降，提示过度训练导致高皮质酮血症出现可能与GR蛋白表达下降，引起的海马损伤及功能失调，HPA轴负反馈障碍有关。

辽东楤木［Aralia elata(Miq.)Seem］，是最接近人参属的一种植物，又称刺龙牙、龙牙楤木，主要分布于我国东北地区，资源丰富。其根味辛，性平，归肝、胃、肾经，有小毒［7］。其药用部位为该植物根皮、树皮及叶。其化学成分有皂甙类化合物，主要是三萜皂甙类，其甙元多为齐墩果酸及其衍生物，如Araloside A，B，C，D，E，F，G，H，I;脂肪类化合物:分别是十五酸甲酯、十六酸甲酯、二十酸甲酯、二十六酸甲酯、二十六碳烯－1、二十六碳醇和二十四酸甲酯、二十四碳饱和脂肪酸、β－谷甾醇 、楤木皂苷A甲酯 、胡萝卜苷－6－棕榈酸酯;挥发油类化合物:证实有37种物质，主要是α－姜黄烯;黄酮类化合物及15种氨基酸和18种以上无机元素等，此外还含有生物碱、鞭质、胆碱等多种成分。

我们的研究结果也发现人参和辽东楤木提取物均可提高海马GR蛋白的表达，对于改善海马对HPA轴负反馈的调节，对降低过度训练导致的应激反应(高皮质醇血症)，避免免疫抑制的发生具有积极作用，且人参提取物优于高、低剂量的辽东楤木提取物。

有学者研究发现，饥俄及低血糖引起血中皮质酮水平升高，诱导大鼠胸腺细胞凋亡，并证明GR介导了这一作用，也有学者研究认为，GC引起胸腺细胞凋亡依赖于NF－кB/c－myc通路，从而引起免疫功能下降。

应激激素对海马的损伤可能是通过凋亡的方式完成的，应激诱发有复杂的起始及中间过程，最终导致其相关基因及基因表达的异常，蛋白质(如GC受体、BDGF等)表达的质或量的异常，反过来又会使其起始及中间过程的紊乱加重，这种恶性循环的形成也许是运动性疲劳，包括运动性高皮质醇、低血睾酮血症及运动性闭经和运动性免疫抑制等慢性运动应激造成的原因之一。

近年来有些学者提出了慢性应激时，可能存在致大脑损害的HPA－Glu－NMDA受体－NO路径。

在慢性应激过程中，持续的HPA轴激活和糖皮质激素(GC)高分泌对海马结构的损害表现为干扰细胞的代谢，降低细胞的生存能力。研究表明，慢性应激时，海马内的Glu的堆积，造成海马的毒性;另一方面，细胞外高水平的Glu又使HPA轴功能亢进，使GC水平更高。过多的Glu释放及其受体激活，引起神经元持续去极化，导致离子渗透压力和电化学改变，继而是钙离子通过电压依赖性钙通道或NMDA受体联结的通道缓慢内流，造成细胞内钙离子超载，结果引起细胞坏死。另外，Glu的损害作用还表现在抑制海马神经元保护因子的合成和释放。

神经元、胶质细胞和脑血管壁均可产生NO，低浓度的NO起信使作用，而高浓度的NO则具有细胞毒性，海马中同时有多种一氧化氮合酶(NOS)分布，而脑内NO浓度过高时，则又会通过其毒性自由基造成细胞组织损伤。

其假说可能为:紧张、应激 新皮层 —→边缘系统兴奋—→HPA轴激活

过量分泌应激激素(包括可的松)—→刺激海马GC敏感性神经元—→HPA轴负反馈障碍—→慢性持续性过量分泌应激激素—→过度刺激GC敏感神经元，使之退化变性—→进行性认知行为失调等。

总之，在慢性应激(过度训练)，从反应行为、解剖结构和神经生化方面可能会引起下丘脑－垂体－肾上腺(HPA)轴的功能亢进，谷氨酸(Glu)的堆积，一氧化氮(NO)的合成异常，神经营养因子(NTF)的下调即可能通过HPA－Glu－NMDA受体－NO途径，损害海马结构等脑组织，导致运动性高皮质醇血症等运动性疾病的发生，这可能是导致过度训练的原因之一。

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