牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用

王嵩，林红丽，王宇鹏，刘振格，王杰，杨明发，余丽芸，侯喜林

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院）

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病[1]。该病是我国进出境动物和国际动物贸易中规定的重点检疫对象[2]。

20世纪50年代在美国首次发现本病并分离到病毒[3]。我国于20世纪70年代在进口牛群中发现该病毒，20世纪80年代分离到病毒。目前我国一些地区的牛群中有此病毒感染，且有逐渐上升的趋势，给养牛业造成了严重危害[4]。研究拟根据GenBank中登陆的IBRV保守基因gB序列[5]，利用本实验室分离鉴定的IBRV DQ株建立快速、准确、高效的诊断IBRV的PCR方法，为该病的临床检疫工作提供实用的技术手段。

1 材料和方法

1.1 病毒和细胞

牛传染性鼻气管炎病毒DQ株（IBRV DQ）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV HJ株）和牛副流感病毒3型（BPIV-3 DQ株）由黑龙江八一农垦大学传染病实验室分离保存；牛肾细胞（MDBK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂

M-MuLV反转录酶（200 U·μL-1）、HPR IRNA酶抑制剂（40 U·μL-1）、dNTP（10mmol·μL-1）购于Promega公司；TaKaRa Taq酶（5 U·μL-1）、10×PCR Buffer、dNTP（2.5mmol·L-1）、DNA Marker DL2000购于TaKaRa公司；DMEM培养基、胰蛋白酶购于Invitrogen公司；胎牛血清购于法 国 PAA Laboratories；二甲基亚砜（DMSO）购于上海华舜生物公司；DEPC水购于江苏省碧云天生物技术研究所；琼脂糖购于哈尔滨宝泰克生物科技有限公司；其他化学试剂为进口或国产分析纯级。

1.3 引物设计

根据GenBank上发表的IBRV的gB基因序列（登录号：M14106）用Primer5.0设计软件设计一对引物。扩增长度为398 bp。引物由上海生工合成，稀释成 20μM，-20℃保存。IBRV上游引物：5＇-CGGCGGTCGAGCGGCAAGAG-3＇；下游引物：5＇-AGGCGGGAACACAGCTGGGACAAT-3＇。

1.4 DNA和RNA的提取

采用SDS-蛋白酶K法[6]提取病毒总DNA。沉淀在真空干燥机中干燥后，用20μL灭菌水溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。按照Trizol Reagent试剂说明提取总RNA，沉淀在真空干燥机中干燥后加入20μLDEPC处理水重悬RNA沉淀备用。

1.5 反转录

20μL反转录体系中，反转录引物（上游）1μL，模板11μL，70℃作用5 min，冰浴2 min；再加入5× M-MuLV Buffer 4.0μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0μL，HPR IRNA酶抑制剂1.0μL，37℃作用5 min；离心后加入M-MuLV反转录酶1.0μL，充分混匀后离心，42℃温浴90min，70℃10 min灭活反转录酶，冰浴2min，-20℃保存备用。

1.6 PCR检测方法的建立

为了摸索引物对的反应条件，以IBRV的DNA为模板，用设计好的引物进行PCR扩增。反应体系为25μL，LA Taq buffer 2.5μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）1.0μL，上、下游引物（20μmol·L-1）各1.0μL，DNA模板2.0μL，LA Taq（5 U·μL-1）0.2μL，加ddH2O至25.0μL。反应程序为：94℃预变性5min，进行32个循环（94℃50 s、55℃50 s、72℃50 s），72℃延伸8min，4℃保存。取PCR产物用10 g·L-1琼脂糖凝胶（EB浓度为 5μg·mL-1）中 200 V电压下电泳10min，在紫外凝胶成像系统中观察结果。

1.7 PCR扩增条件的优化

将IBRV的DNA作为模板，对PCR中的引物浓度（3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μM）、dNTP浓度（0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01μM）及PCR反应的退火温度（55.1℃、56.0℃、57.2℃、58.5℃、60.1℃、61.6℃、63.3℃、65.1℃和66.2℃）等条件进行优化，筛选PCR扩增的最佳反应体系和程序。

1.8 特异性和敏感性实验

按照SDS-蛋白酶K法提取IBRV DQ株和MDBK细胞总DNA；按照Trizol Reagent法分别提取BRSV HJ株，BPIV-3 DQ株的总RNA，反转录获得cDNA，同时用灭菌水进行空白对照，采用优化后的PCR反应体系 [反应体系为25μL，LA Taq buffer 2.5μL，dNTP（2.5μM）0.5μL，上、下游引物（20μM）各 1.0μL，DNA模板 2.0μL，LA Taq（5 U·μL-1）0.2μL，加ddH2O至25.0μL]和反应条件（94℃5min；94℃ 50 s、63℃ 50 s、72℃ 50 s，32个循环；72℃8min，4℃保存）进行特异性试验。将已知病毒滴度（IBRV 101TCID50·mL-1）的病毒培养物分别进行10倍梯度稀释，然后进行DNA的提取及PCR扩增，反应结束后进行凝胶电泳检测，以检测PCR反应的敏感性。

1.9 临床样品的检测

利用建立的PCR检测方法对送检的17份疑似病料进行检测，17份被检血清来自黑龙江省哈尔滨市某牛场。采血时空腹、颈静脉采血，采血后成斜面摆放，室温中待血清析出后收集血清，-20℃保存待检。

2 结果

2.1 PCR反应的优化结果

通过PCR扩增条件优化，最终确定反应循环参数为：94℃5 min；94℃50 s、63℃50 s、72℃50 s，32个循环；72℃8 min，4℃保存。以此优化条件对IBRV DNA模板做单重PCR，用10 g·L-1琼脂糖进行凝胶电泳，可观察到398 bp的条带，大小与预期相符（图1）。

图1 PCR扩增结果Fig.1 Results of PCR amplification

2.2 引物浓度及dNTP浓度对PCR反应的影响

分别选择了引物5个不同浓度及dNTP 6个不同浓度来进行测定，结果表明最佳引物终浓度在0.4～1.6μM之间，最佳dNTP浓度在0.01～0.5 mM之间（图2，图3）。

图2 引物浓度的测定结果Fig.2 Determination of concentration of primer

2.3 退火温度对PCR反应的影响

选择了9个温度梯度来研究退火温度对PCR反应的影响，结果在61.6～66.2℃之间均能扩增出明显的目的带（图4）。

2.4 PCR反应的特异性

用IBRV的1对引物分别对以下病原体检测结果显示，只有IBRV扩增出特异性条带，而其他对照组均未扩增出明显条带（图5）。

图3 dNTP浓度的测定结果Fig.3 Determination of concentration of dNTP

图4 退火温度的测定结果Fig.4 Determination of anneal temperature

图5 特异性实验结果Fig.5 Determination of specificity test

2.5 PCR反应的敏感性

取实验室分离保存的毒株，IBRV DQ株的毒力为101TCID50·mL-1。将病毒培养物进行10倍梯度稀释，分别取稀释病毒提取总DNA，进行PCR扩增。结果显示，该PCR反应的敏感性为10-3TCID50·mL-1（图6）。

图6 敏感性实验结果Fig.6 Determination of sensitivity test

2.6 临床样品检测结果

利用单重PCR对临床上的17份疑似病料进行检测，结果IBRV感染有7份为阳性，10份IBRV感染为阴性；病毒分离鉴定结果IBRV感染有5份为阳性，12份IBRV感染为阴性，PCR方法灵敏度高于病毒分离方法。

3 讨论

PCR方法可以针对不同的靶序列进行快速、准确的诊断，在国内外得到了广泛应用。研究建立的单重PCR方法能在反应中对病料中的IBRV进行检测，该方法特异、敏感、快速、简便，具有广泛的应用前景。在进行PCR反应的研究中，引物的设计至关重要[6-7]，研究设计的引物GC%含量适当，这就保证了在恰当的退火温度下IBRV的目的片段都能得到有效扩增。另外，利用DNAStar对引物进行了同源性和二级结构等分析，以避免引物之间形成复杂的二级结构及引物二聚体而影响扩增结果的判定[8]。引物的浓度在PCR反应中十分重要，需要多次试验确定最适浓度[9-10]。实验过程中发现，当引物浓度减小至0.2μM时，目的条带开始不清晰；当引物浓度增加至1.6μM时，出现了大量引物二聚体。因此PCR反应中引物浓度一定要进行优化。

在敏感性实验过程中，相关研究采用测量DNA浓度来测定PCR方法的敏感性，这样忽略了病毒DNA的提取对结果的影响，不足以代表PCR反应的整个过程。实验采用测量阳性病毒液TCID50·mL-1的方法，测定PCR方法的敏感性，可检测出IBRV的敏感性为10-3TCID50·mL-1，表明此方法有较高的敏感性。目前ELISA方法常用于IBRV的大批量检测，然而所用的试剂盒费用高，反应时间长，且灵敏度不高[11]。对临床样品的检测结果表明，该PCR方法可从病料中成功检测到IBRV，且灵敏度高于病毒分离方法，证明本方法可用于临床病例的诊断，该方法也可用于IBRV感染的分子流行病学调查和疫情监控，同时为研究IBRV感染早期诊断提供了技术手段，也为诊断试剂盒的研制奠定了基础。

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