胰酶提升小麦蛋白酶解产物乳化活性工艺及其功能特性研究

阙 斐，赵 粼，陈锡威

（1.浙江经贸职业技术学院应用工程系，浙江杭州310018；2.杭州康源食品科技有限公司，浙江杭州310000）

小麦蛋白粉是生产小麦淀粉时的副产品，含人体必需的十五种氨基酸，是一种营养丰富的植物蛋白源，但含有较多的疏水性氨基酸和不带电荷的氨基酸，溶解度较低，不能满足加工的需要，应用受到限制。目前，由于反应条件温和、可控性强、能耗低、安全天然等优点，运用酶水解改性小麦蛋白粉已经逐渐成为研究热点，张影陆[1]、Xiangzhen Kong[2]、张锐昌[3]、齐军茹等[4]研究了胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等单酶对小麦蛋白进行改性的效果，而孙丽平[5]、唐胜[6]、林敏刚等[7]研究了碱性蛋白酶和风味酶、米曲霉生长产生的复合酶对小麦蛋白进行改性的效果，改性后的小麦蛋白由于分子结构发生变化，从而使酶解产物的水溶性、乳化性、起泡性、吸水性、粘弹性等功能性质产生较大变化，因此酶解物可作为食品添加剂、营养补充剂、饲料添加剂进行开发，拓宽了小麦蛋白的应用范围。其中碱性酶、胰酶等，由于可以在碱性条件下较大程度地水解小麦蛋白，产生明显的改性效果，因此是研究重点，但是目前的报道中，系统的工艺研究与功能特性研究相结合的报道较少。本文以乳化活力为指标，通过正交实验，较为系统地研究了胰酶水解小麦蛋白的工艺条件，随后研究了酶解产物的抗氧化活性、分子量分布、氨基酸组成等功能特性，结果可为小麦蛋白深加工开发与工业化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦蛋白粉 购自徐州澳凯小麦淀粉有限公司；胰酶 购自广西庞博生物工程有限公司；纯花生油 购自山东鲁花集团有限公司；DPPH自由基、Ferrozine试剂、AA-S-18氨基酸混标 Sigma公司；其他试剂 均为分析纯与色谱纯。

HH-4型水浴锅 国华电器有限公司；T6系列紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；pHS-25B型酸度计 上海大中分析仪器厂；90-1型恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂；600型高效液相色谱仪 Waters公司，配2487紫外检测器和Empower工作站带GPC软件；TSK系列凝胶色谱柱（G2500PWXL 7.8mm×300mm）；C18柱（4.6mm×250mm，5μm） Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胰酶活力测定 采用GB/T 23527-2009蛋白酶制剂附录B福林法。

1.2.2 原始小麦蛋白粉粗蛋白含量测定 采用GB 5009.5-2010食品中蛋白质的测定中的凯氏定氮法进行。

1.2.3 胰酶水解小麦蛋白的工艺流程 适量的蒸馏水→在一定温度的水浴锅中保温→加入一定量的小麦蛋白粉（底物浓度5%）并搅拌→调节溶液的pH于设定的条件→加入适量的胰蛋白酶进行酶解→用1moL/L的NaOH保持溶液的pH不变→搅拌酶解2h→立即在95℃条件下灭酶10min→酶解液。

1.2.4 胰酶水解小麦蛋白工艺优化

1.2.4.1 单因素实验设计 依次改变酶解pH、温度、E/S（酶浓度，即酶与底物比），以酶解产物乳化活力指数作为指标进行单因素实验。

称取5g小麦蛋白粉于95mL的蒸馏水中，按照固定条件加入胰酶0.05g，水浴温度为50℃，调节酶解pH分别为pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。

称取5g小麦蛋白粉于95mL的蒸馏水中，按照固定条件加入胰酶0.05g，并调pH至8.5，分别于35、40、45、50、55℃水浴中进行反应。

表1 L9（34）正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

称取5g小麦蛋白粉于95mL的蒸馏水中，按固定条件调pH至8.5，水浴温度为50℃，分别加入胰酶0.05、0.15、0.25、0.35、0.45g，使酶浓度分别为1%、3%、5%、 7%、9%进行反应。

1.2.4.2 正交实验设计 根据单因素实验结果，确定了三因素三水平的正交实验，以乳化活力指数为指标，水解度为参考，采取L9（34）正交表进行实验，因素水平表如表1。

1.2.5 小麦蛋白酶解产物乳化性能测定[8]取45mL蛋白质浓度为0.1%的小麦蛋白酶解溶液（用0.2mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释），加入15mL纯正花生油，在10000r/min、室温下搅拌1min，分别在搅拌0、5、10min后从底部取样。以0.1%（W/V）SDS（十二烷基硫酸钠）稀释100倍，测定500nm处的吸光值A500，以SDS溶液为空白。乳化性能由乳化活力指数EAI表示，计算公式如下：

式中，EAI：乳化活力指数，即每克蛋白质的乳化面积，m2/g；N：稀释倍数；Ф：油相所占的分数，本实验中油相占1/4；L：比色池光径，1cm；C：蛋白质的浓度，g/mL。

1.2.6 小麦蛋白水解度的测定 水解度（DH）测定采用pH-stat法[9]，计算方法如下：

式中，VNaOH为消耗碱液的体积（mL）；NNaOH为消耗碱液的摩尔浓度（mol/L）；а为氨基酸的解离常数；Mp为参加水解的蛋白质总量（g）；Htot为1g原料蛋白质中肽键的mmol数，小麦蛋白取9.2。

1.2.7 清除DPPH自由基能力测定 清除DPPH自由基使用的是Que等的方法[10]。取50、100、200μL正交优化工艺所得的小麦蛋白酶解液，用蒸馏水补充为2mL，分别加入2mL 0.1mmol/L的DPPH自由基醇溶液加入。室温放置30min，于517nm处测定吸光值。用VC作为阳性对照，浓度为1mg/mL。根据下式计算清除率：

式中，A0：空白在517nm处吸光值；A1：样品在517nm处吸光值。

1.2.8 金属螯合能力测定 金属鳌合能力使用Que等的方法进行测定[10]。一些金属离子在脂质氧化过程中起催化作用，如铁离子、铜离子等，因此具有对这些金属鳌合作用的物质可以间接地起到抗氧化的作用。Ferrozine试剂能够与脂质氧化催化剂Fe2+形成为紫红色络合物，当其他有竞争力的络和剂存在时，紫红色会变浅。因此通过络和物颜色的变化，可以评价物质对Fe2+螯合能力，从而评价该物质的抗氧化能力。取200、500、1000μL的正交优化工艺所得的小麦蛋白酶解液，用蒸馏水补充为4.7mL，分别加入0.1mL 2mmol/L的FeCl2和0.2mL 5mmol/L Ferrozine。然后放置于室温20min，于562nm测定吸光值。用浓度为1mg/mL EDTA和柠檬酸作为阳性对照。螯合能力用下式进行计算：

式中，A0：空白在562nm处吸光值；A1：样品在562nm处吸光值。

1.2.9 小麦蛋白酶解产物分子量分布 采用GBT 22729-2008海洋鱼低聚肽附录A高效凝胶过滤色谱法测定正交优化工艺所得的小麦蛋白酶解液中蛋白质分子量的分布。

1.2.10 小麦蛋白酶解产物氨基酸组成 正交优化工艺所得的小麦蛋白酶解液中氨基酸组成用吕艳等[11]的方法进行测定。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶活力测定

测得实验所用的胰酶酶活为1657.43U/g。

2.2 原始小麦蛋白粉的基本数据

测得实验所用原始小麦蛋白粉中粗蛋白含量为75.23%、EAI值为5.27m2/g。

2.3 单因素实验结果与分析

2.3.1 pH对小麦蛋白酶解产物乳化活性的影响 pH对小麦蛋白酶解产物乳化活性的影响结果如图1所示。在pH在7.5～9.5时，小麦蛋白酶解产物的乳化活力指数先增后减。这可能是因为当pH增大时，由于羟基作用使蛋白质中羧基的暴露增多，从而增加了分子间的静电斥力，使离散双电层增加，溶液界面膜增厚，提高了乳化性；同时，酶活增加，反应速率加快，同样提高了其乳化性。但是随pH继续增大，酶水解的质子化和去质子化受pH影响较大，从而影响酶对小麦蛋白水解，乳化性下降[12]。因此正交实验选取了pH7.5～9.0作为研究水平。

图1 pH对酶解液乳化活力指数的影响Fig.1 Influence of pH on the EAI of the hydrolysate

图2 温度对酶解液乳化活力指数的影响Fig.2 Influence of temperature on the EAI of the hydrolysate

2.3.2 温度对小麦蛋白酶解产物乳化活性的影响 温度对小麦蛋白酶解产物乳化活性的影响结果如图2所示。在蛋白酶的最适温度范围内，随着温度的升高，单位时间内分子间的有效接触次数增加，有利于蛋白的酶解。小麦蛋白酶解产物在35～40℃时EAI逐渐下降，而温度在40℃左右时其乳化活力指数最低，而在温度大于40℃后乳化活力指数呈上升趋势，并且温度55℃时乳化活力指数相对较大，并逐渐趋于平缓，由此可见，适当的增加反应温度，会使小麦蛋白的乳化能力提高，但是温度过高会使小麦中蛋白质变性，同时小麦淀粉开始糊化[13]，乳化能力反而下降，因此正交实验选取了45～55℃作为研究水平。

2.3.3 酶浓度对小麦蛋白酶解产物乳化活性的影响酶浓度对小麦蛋白酶解产物乳化活性的影响结果如图3所示。小麦蛋白酶解产物在酶浓度为1%时乳化活力指数最大，当在酶浓度增大至5%时，乳化活力指数逐渐减小，并趋于平缓。这可能是由于适当的酶浓度使小麦蛋白分子断裂成较多亲水性较强的小肽，分子内部疏水基团暴露，增加了蛋白质的疏水部分，有利于胶束的形成，形成水包油结构，促使乳化活性提高。但当酶浓度太大时，其水解出的更短的小肽，极性更小，形成了油包水结构，乳化活性反而降低[14]。因此正交实验选取了酶浓度1%～3%作为研究水平。

图3 酶浓度（E/S）对酶解液乳化活力指数的影响Fig.3 Influence of enzyme concentration（E/S）on the EAI of the hydrolysate

2.4 胰酶水解小麦蛋白工艺优化

表2 正交实验设计及结果Table 2 Results of orthogonal design

根据单因素实验结果，选取影响小麦蛋白酶解产物乳化活性因素中有意义的水平做正交实验，对结果进行极差分析，以确定最佳酶解工艺条件。按照表1的因素水平，设计L9（34）正交实验，结果见表2。

由表2数据极差分析可知，RC＞RB＞RA，各因素对乳化活性影响程度依次为：酶浓度＞温度＞pH，酶浓度对小麦蛋白酶解产物乳化活性影响最为显著，在实验设计范围内，优化得到小麦蛋白酶解的最佳工艺条件为：A1B1C1，即pH7.5、温度45℃、酶浓度E/S为1%，此时乳化活力指数为35.38m2/g。原始小麦蛋白粉的乳化活力指数仅为5.27m2/g，酶解产物的乳化活性有了明显的提升，也显著强于本课题组利用酸性蛋白酶对小麦蛋白粉进行改性的最优结果（17.69m2/g）[15]，这可能是由于本实验所用的胰酶为复合酶，内含胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类，比使用单一酶类酶解产生更显著的改性作用[16]。

最优条件下水解度为4.73%，相对来说较低（表2）。很多研究都希望通过酶解改性小麦蛋白，以获得较高的水解度，从而改善小麦蛋白的溶解性。但是从提升乳化活性角度来说，相对较低的水解度能够获得较高的乳化活性。这可能是由于水解度越大，水解出的肽段越小，包裹在油滴表面的保护层越薄，同时小麦蛋白链上的末端基团数目增加，电荷增大到一定程度，吸附油滴的能力降低，最终导致乳化性能降低[17]。

2.5 小麦蛋白酶解产物清除DPPH自由基的能力

张玲[18]、崔凤杰[19]、Wang等[20]报道了小麦蛋白酶解产物具有DPPH自由基清除能力，本实验（图4）也证实了最佳工艺条件下（酶浓度为1%、温度45℃、pH7.5）的小麦蛋白水解液具有一定的DPPH自由基清除能力，当用量为200μL时，清除率为30.2%，但是显著低于VC。清除率偏低可能由于酶解液中仍含有一定分子量的蛋白，而DPPH溶液由乙醇溶解，在测定过程中，蛋白会变性而影响实验结果。

图4 胰酶水解小麦蛋白产物的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of the hydrolysate

2.6 小麦蛋白酶解产物金属螯合能力

一些植物性原料，如黄花菜[21]、南瓜[22]提取物具备明显的金属螯合能力。本实验首次发现小麦蛋白胰酶水解产物具有较强的螯合能力（图5），用量为1000μL时，达到71.3%，显著强于柠檬酸，但显著低于EDTA。这可能是由于水解液含有未水解的蛋白质与水解后的多肽，这些物质能和铁离子发生络合反应；同时，也可能在酶解反应时，由于淀粉酶的存在，生成了还原糖，还原糖与蛋白质、酶解产生的多肽、氨基酸等发生了美拉德反应，产生了大量的呋喃类、吡嗪类、噻吩类、噻唑类等物质[23]，这些物质能够络合铁离子。

图5 胰酶水解小麦蛋白产物的金属螯合能力Fig.5 Metal chelating activity of the hydrolysate

2.7 小麦蛋白酶解产物分子量分布

采用GBT 22729-2008海洋鱼低聚肽附录A中的方法，测定最佳工艺条件下的小麦蛋白酶解液（水溶性部分）的分子量分布，分离图谱如图6所示，分子量分布表如表3所示。实验结果表明，胰酶水解小麦蛋白产物的分子量主要分布在200～1000u，占65.99%，其次为1000～2000u，占12.34%，分子量较小，大部分是亲水性较强的肽类，能够适当增加蛋白质的水溶性，此时酶解产物中亲水基团和亲油基团形成了较为合适的比例，因而改善了小麦蛋白的乳化性能。同时分子量较小的肽容易穿过细胞膜从而更好地发挥生物活性，分子量小于3000u的肽类具有明显的自由基清除能力[18]，因此这些肽类可能是酶解产物具备有乳化活性、抗氧化活性等功能特性的重要贡献者。

图6 胰酶水解小麦蛋白产物的分子量测定图谱Fig.6 Chromatogram of molecular weight in the hydrolysate

表3 胰酶水解小麦蛋白产物的分子量分布Table 3 Distribution of molecular weight in the hydrolysate

2.8 小麦蛋白酶解产物氨基酸组成

取小麦蛋白酶解产物样品，按设定条件进行衍生和HPLC分离，小麦蛋白酶解产物中各种氨基酸的含量如表4。酶解产物经完全水解后，获得了15种氨基酸，总含量为3.76%（w/v），与张玲[17]的报道相似，其中谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量较多，谷氨酸含量达30.48%，其在蛋白质中以谷胺酰胺形式存在，是一种条件必需基酸；同时，人体必需的氨基酸含量达7种。

表4 胰酶水解小麦蛋白产物的氨基酸组成Table 4 Content of amino acids in the hydrolysate

3 结论

本文以乳化活力为指标，系统地研究了胰酶水解小麦蛋白的工艺条件，酶解产物的抗氧化活性、分子量分布、氨基酸组成等功能特性。结果表明，最佳酶解条件为：酶浓度E/S为1%、温度45℃、pH7.5，乳化活力指数达到35.38m2/g，此时水解度为4.73%，显著提升了小麦蛋白的乳化活性。根据极差分析，三因素对乳化活力的影响大小为：酶浓度＞温度＞pH。最佳工艺条件下的小麦蛋白酶解液具有一定的DPPH自由基清除能力，但显著低于VC；首次发现了酶解液具有较强的金属螯合能力，显著强于课题组在类似条件下利用酸性酶、碱性酶、木瓜蛋白酶对小麦蛋白进行改性的产物的金属螯合能力。酶解小麦蛋白产物中多肽分子量主要分布在1000～200u，占65.99%；酶解产物中共检测出了15种氨基酸，谷氨酸含量最高，达30.48%；肽类可能是酶解产物具备有乳化活性、抗氧化活性等功能特性的重要贡献者。

综上，胰酶水解小麦蛋白产物具有较大的食品添加剂、保健产品开发价值。但是值得注意的是，酶解产物中含有较多的苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和酪氨酸四种具有较强苦味的氨基酸（15.25%），这些氨基酸大部分并不能被蛋白酶水解下来，而是存在于肽链中，形成分子量为500～1000u的多肽，这些多肽对酶解产物的风味会造成严重的影响，这也是酶解产物有苦味、麦麸味的原因，因此必须进一步研究酶解产物脱除异味的方法，以期为更好地应用开发。

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