玉米胚芽蛋白的碱法提取工艺及特性研究

任秀艳，曹 戈，王孟云，马科佳，陈峰青，徐文秀，李旭灿

（廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊065000）

玉米胚芽是玉米淀粉工业和酒精工业的副产品，除含有营养价值极高的油脂外，还含有18%～22%的优质蛋白质[1]。玉米胚芽蛋白的生物价高于大米和精制面粉，蛋白质功效比值（PER）与大豆蛋白、酪蛋白相当；玉米胚芽蛋白的氨基酸评分（AAS）在常用谷物中最高，氨基酸组成和鸡蛋白非常相似，与FAO/WHO推荐的人类蛋白质标准具有较好的一致性，是一种优质的蛋白质资源[2]。然而，目前国内对玉米胚芽主要偏重于油脂方面的研究，对玉米胚芽蛋白的研究报道较少，尤其对玉米胚芽蛋白功能性质的研究报道更为少见。我国是玉米种植大国，有丰富的玉米胚芽资源，为了很好地开发这一资源，对玉米胚芽蛋白功能性质的研究极为重要。

蛋白质的提取方法主要有物理法、碱法和酶法三种。物理法提取蛋白质，回收率较低，仅可作为玉米胚芽蛋白提取的辅助手段；酶法提取条件温和、蛋白提取率较高，但该法技术性强、相对成本高，目前仅处于实验阶段[3]；碱法是经典的蛋白质提取方式，特别是在果实、种子等作物的蛋白质提取中应用广泛，虽然在提取过程中会部分改变蛋白理化及营养特性，但该方法得率高、成本低、适合工业化生产，仍被认为是一种蛋白提取的有效方法[4]。

目前对玉米胚芽蛋白提取的研究中，多强调蛋白提取率，忽视了对蛋白特性的研究，进而影响了它在食品加工领域的应用。本实验以玉米胚芽粕为原料，采用碱法提取蛋白，主要目的是通过对影响玉米胚芽蛋白提取因素的考察，得出玉米胚芽粕蛋白的最佳提取条件，同时对所得到的玉米胚芽蛋白的特性进行研究，为玉米胚芽蛋白的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米胚芽粕 经高温榨取提油后，粉碎过100目筛；大豆油 金龙鱼牌，购自廊坊元辰超市；其他试剂 均为分析纯。

78-1型恒速搅拌器 常州国华电器有限公司；ZSBB-712型数控恒温水浴锅 上海智诚分析仪器制造有限公司；FA1004型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；ESB-500型摆式高速粉碎机 上海易勒机电有限公司；Anke TDL-40B型台式高速大容量冷冻离心机 上海安平科学仪器厂；ZRD-5210型全自动新型鼓风干燥箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；FD-1D-50型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；PHSJ-4A型pH计 上海精密科学仪器有限公司；FS-1型分散器 金坛市精达仪器制造厂；UV2100型紫外可见分光光度计 贵州赛兰博科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米胚芽蛋白提取工艺 称取50g玉米胚芽粕置于三角瓶中，加45mL蒸馏水，用1mol/L NaOH调pH8.5，于30℃恒温振荡提取2h，4000r/min离心20min，上清液用0.1mol/L HCl调节pH至等电点，静置沉淀，4000r/min离心20min，沉淀经真空冷冻干燥，得到玉米胚芽蛋白。

1.2.2 蛋白质含量和提取率测定 蛋白质含量采用微量凯氏定氮法（换算系数6.25）测定。

式中，W1—提取物中蛋白质的质量（g）；W0—玉米胚芽粕中蛋白质的质量（g）。

1.2.3 氨基酸分析 采用RP-HPLC在254nm检测波长下测定玉米胚芽蛋白的氨基酸组成，处理好的样品采用PICO.TAG氨基酸柱分析，测定温度为38℃，流速1mL/min。

1.2.4 蛋白溶解度测定 称取0.5g玉米胚芽蛋白，加10mL不同pH的溶液，经磁力搅拌器搅拌30min后，4000r/min离心15min，用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质的质量。

式中，C1—上清液中蛋白质的质量（g）；C0—样品中蛋白质的质量（g）。

1.2.5 蛋白乳化性测定 取5%的蛋白溶液50mL，加入50mL大豆油，用高速分散器在12000r/min下分散2min，1500r/min离心5min，测量液体总高度和乳化层高度。

式中，H1—乳化层高度（cm）；H0—离心管液体总高度（cm）。

1.2.6 蛋白持水性测定 称取1.5g玉米胚芽蛋白置于（聚碳酸酯）离心管中，称重m1。加10mL蒸馏水，振荡摇匀，使样品分散于水中。然后将装有玉米胚芽蛋白质溶液的离心管放在60℃恒温水浴锅中保温30min，后在冷水中冷却30min，再4000r/min离心30min，倒上清液，称重离心管和沉淀的重量m2，并计算每克玉米胚芽蛋白的持水力（WHC），计算公式如下：

式中，m1—玉米胚芽粕和离心管的重量（g）；m2—蛋白沉淀和离心管的重量（g）。

1.2.7 蛋白持油性测定 称取1.5g玉米胚芽蛋白置于离心管中，称重m1，加入10mL大豆油，调节pH为7.0，混合均匀，在80℃恒温水浴锅中保温30min，后在冷水中冷却30min，再4000r/min离心30min，倒出上清液，称重离心管和沉淀的重量m2，并计算每克玉米胚芽蛋白的持油力，计算公式如下：

式中，m1—玉米胚芽粕和离心管的重量（g）；m2—蛋白沉淀和离心管的重量（g）。

1.2.8 蛋白起泡性测定 配1%玉米胚芽蛋白溶液5mL，用高速分散器在12000r/min下分散2min，读取泡沫体积。

式中，V—泡沫的体积（mL）；V0—溶解样品水溶液的体积（mL）。

1.2.9 实验设计

1.2.9.1 单因素实验 分别对影响玉米胚芽蛋白的提取的4个主要条件，即料液比、pH、提取温度、提取时间进行单因素实验。单因素实验中除了变量以外所选取的固定条件分别为：料液比1∶12、pH9、提取温度50℃、提取时间3.5h。

1.2.9.2 正交实验 根据单因素实验结果，选取料液比、pH、提取温度、提取时间4个因素，以蛋白提取率为考察指标，进行四因素三水平正交实验。实验设计见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对蛋白提取率的影响 设置不同的料液比（1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18）在pH9、温度为50℃、提取时间3.5h下进行蛋白提取，结果如图1所示。由图1可知，当料液比低于1∶12时，玉米胚芽蛋白提取率明显升高，当料液比为1∶12时，蛋白提取率可达最大值，此结果与顾尤[5]的研究结果相似。当料液比介于1∶12～1∶18之间时，玉米胚芽粕蛋白提取率随提取液的增加略有下降，但变化不明显。因此，玉米胚芽粕蛋白提取最适料液比为1∶12。

2.1.2 pH对蛋白提取率的影响 分别选取不同的pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）在料液比1∶12、温度50℃、时间3.5h下进行蛋白提取，结果如图2所示。由图2可知，随着pH的增加，玉米胚芽蛋白提取率呈先上升后下降的趋势，在pH达9.5时，蛋白提取率最大，其原因是随pH的增加，蛋白质与水之间的相互作用力增强，蛋白溶解性提高，进而使蛋白提取率明显上升。当pH为9.5～10.0时，蛋白提取率开始下降。已有实验证明，碱浓度过高会导致溶液中淀粉发生糊化现象，而是溶液粘度增加[6]，进而导致蛋白提取率下降。另外，pH过高容易使蛋白质分子脱氨、脱羧、肽键断裂，同时会发生“胱赖反应”，把氨基酸转化成有毒的化合物，影响蛋白的安全性[7-8]，因此，玉米胚芽蛋白提取的最适pH为9.5。

图1 料液比对玉米胚芽蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of solvent/solid ratio on the extract content of protein

图2 pH对玉米胚芽蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of pH on the extract content of protein

图3 提取温度对玉米胚芽蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extract content of protein

2.1.3 温度对蛋白提取率的影响 分别选取不同温度（30、40、50、60、70℃）在料液比1∶12、pH9、提取时间为3.5h下测定玉米胚芽蛋白提取率，结果见图3。由图3可知，随着温度的升高，蛋白提取率呈先升后降的趋势，结果与张娜等的结果相似[9]，当温度达到40℃时，蛋白提取率最大。温度在30～40℃时，蛋白提取率随温度升高而上升，其原因可能是温度适当升高会使蛋白质分子的构象发生变化，立体结构的伸展对蛋白有一定的增溶效果[10]。当温度超过40℃时，蛋白提取率随温度的升高而下降。原因可能是溶液中残留的淀粉由于温度的升高而逐渐产生糊化现象，使溶液粘度增加，阻碍了提取时蛋白质的析出，从而造成提取率的降低[11]。因此，最佳提取温度为40℃。

2.1.4 提取时间对蛋白提取率的影响 分别设置不同提取时间（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）在料液比1∶12、pH9、提取温度为50℃下测定蛋白提取率，结果如图4所示。由图4可知，随着提取时间的延长，玉米胚芽蛋白质提取率呈先上升后下降的趋势，在提取时间为3.5h时，蛋白提取率最大，达到21.96%。在时间较短时，蛋白质的总提取率较低，可能是因为短时间内蛋白质没有得到充分溶解；在3.5h后蛋白提取率下降，可能是因为随着浸提时间的延长，蛋白质会被微生物感染而变质[12]，从而导致蛋白质提取率下降。因此，玉米胚芽粕蛋白提取最适提取时间为3.5h。

图4 提取时间对玉米胚芽蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extract content of protein

2.2 正交实验

由表2的极差分析可知，各因素对提取效果的影响是不同的，顺序为料液比＞pH＞提取温度＞提取时间，最佳组合为A2B2C2D3，即料液比1∶12、pH9.5、温度50℃、时间4h。按此优化条件进行实验验证，玉米胚芽粕蛋白提取率为23.05%，验证结果表明，此优化工艺条件可行。

由表3方差分析结果可以看出，料液比和提取液pH对胚芽蛋白提取率的影响是显著的，而温度和提取时间的影响相对较弱。

2.3 玉米胚芽粕蛋白的特性研究

2.3.1 玉米胚芽粕蛋白氨基酸分析 由玉米胚芽粕蛋白的氨基酸分析结果（表4）可知，谷氨酸是玉米胚芽蛋白中含量最高的氨基酸，其含量为每100g胚芽蛋白中含有6765.03mg，其次是精氨酸，其含量为每100g胚芽蛋白中含有4265.81mg；且玉米胚芽蛋白中富含人体必须的八种氨基酸，其中缬氨酸和亮氨酸含量较高，分别为每100g胚芽蛋白中含1887.58mg和 2312.16mg。

表2 正交实验方案及结果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

2.3.2 玉米胚芽粕蛋白的溶解性 由图5中可知，pH在2～9范围内时，玉米胚芽粕蛋白的pH-溶解度曲线基本符合“V”字形，pH大于9.0时，蛋白溶解度下降。在pH2～5范围内，其溶解度较低，特别是在pH为4.0时，由于接近蛋白的等电点，其溶解度约为20%，但随着pH的增加，蛋白溶解度明显增加，当pH达到9时，80%的蛋白质都已溶解，说明pH对蛋白的溶解性影响较大。这种溶解度的变化反映酸碱处理对蛋白质二三级构象的改变作用[13]。在等电点附近蛋白质多肽链之间的静电排斥作用受到抑制，以及蛋白质间的相互作用超过蛋白质与溶剂间的相互作用而引起了聚集反应，从而破坏了蛋白质的空间结构。pH大于9.0时，其溶解度下降，原因是由于强碱的作用是溶液中残留的淀粉产生糊化现象，使溶液粘度增大，蛋白不易析出，从而使蛋白溶解度下降。

图5 玉米胚芽蛋白的溶解度Fig.5 Solubility of corn germ meal protein

2.3.3 玉米胚芽蛋白加工特性 蛋白质产品在食品工业的应用范围取决于其加工特性。玉米胚芽蛋白的持水性为211.6%，低于酪蛋白（248%）；其持油性为444.8%，显著高于酪蛋白（172%）[14]和大豆分离蛋白（216%），这说明其表面含有较多的疏水因子，进而表现出强持油性和弱持水性，因此玉米胚芽蛋白可以应用于烘培食品、油炸食品和面制品中。

乳化特性是利用蛋白质分子结构中的亲水和亲油基团，吸附在油-水界面上，形成一层膜，从而阻止油滴的聚集，达到稳定乳化的作用[15]。玉米胚芽蛋白的乳化特性高于酪蛋白（48%）和籼米蛋白（45%），这说明该蛋白在油水界面具有较强的形成连续相的能力[16]。因此，玉米胚芽蛋白可用于罐头食品、乳制品（人造乳、豆奶和豆奶酪等）和肉制品加工（香肠、肉丸和肉汤等）中。

起泡性反映了蛋白质溶解扩散到气/水界面，并能在气/水界面发生构象转变的能力[17]。蛋白质的发泡性可以赋予食品以疏松的结构和良好的口感。玉米胚芽蛋白的起泡性高于酪蛋白（14.3%），因此玉米胚芽蛋白可用于蛋糕面糊、人造稠黄油、饮料、餐后甜点和蜜饯的制作中。

表4 玉米胚芽蛋白的氨基酸组成Table 4 Compositions and contents of amino acids in corn germ meal protein

表5 玉米胚芽蛋白的加工特性Table 5 Processing properties of corn germ meal protein

3 结论

本文研究了各种因素对玉米胚芽蛋白提取率的影响，通过正交实验优化了提取条件，确定了最佳提取条件为液料比为1∶12、pH9.5，提取温度50℃，提取时间4h，在此条件下提取玉米胚芽蛋白，提取率达到23.05%。这个结果顾尤等[5]对玉米胚芽进行蛋白质提取时的蛋白提取率（14%～17%）。为了进一步提高蛋白提取率，我们在后期的研究中采用碱酶两步法对玉米胚芽蛋白进行提取[18]。蛋白得率已有所提高。采用传统的“碱溶酸沉”及酶解相结合的方法提取玉米胚芽蛋白，简单可行，既适应工业化生产的需求，又避免了目前玉米胚芽粕的大量浪费或者只是进行简单脱毒处理作为动物饲料。综合我国玉米饼粕的丰富资源与其低利用率间的矛盾问题，本研究的实施具有一定的应用价值。

通过液相色谱分析可知，玉米胚芽蛋白中谷氨酸和精氨酸含量较高，均在10%以上，且玉米胚芽蛋白中富含人体所需的八种氨基酸；另外，该蛋白具有良好的溶解性、乳化性、起泡性、持水性和持油性。

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