花楸叶活性成分提取工艺的优化

柴军红，何婷婷，金志民，马怀良，肖杰，张鹏

（牡丹江师范学院，黑龙江牡丹江157011）

花楸叶活性成分提取工艺的优化

柴军红，何婷婷，金志民，马怀良，肖杰，张鹏

（牡丹江师范学院，黑龙江牡丹江157011）

建立花楸叶中黄酮、多糖、萜类同步快速提取工艺，以期为花楸叶活性成分药用价值开发提供工艺基础。以花楸叶为原料，以总黄酮、多糖、总萜提取率为技术指标，通过提取方法对比试验，采用正交设计与多指标综合分析法（权重）探讨提取工艺的影响因素。影响因素顺序依次是：超声波时间＞乙醇浓度＞pH（料液比）＞酶添加量，优化最佳工艺参数：超声波时间25min，乙醇浓度50%，料液比1∶25（g/mL），pH=4，酶添加量5mg/g。本工艺3种主要指标均比传统提取法有很大提高，放大20倍实验表明工艺较为稳定，标准偏差均在3%以内。

花楸叶；黄酮；多糖；萜类；工艺优化

花楸为蔷薇科花楸属植物，常用于治疗肺结核、哮喘、咳嗽、胃痛等症。花楸叶中富含三萜类、甾醇类、黄酮类、胡萝卜烃类、二联苯类和木脂素类、生氰苷类、有机酸类、花楸酸及其苷类化合物[1]。除以上各种化合物外，花楸属植物中还含有烷（醇）类，间苯三酚，D-山梨酸，氨基酸和VC等成分。其中黄酮类、萜类、多糖是主要活性物质，药理作用上有强抗氧化、抗癌、抗辐射和止咳平喘等作用而引起国内外研究及关注。

以牡丹江产花楸叶（经牡丹江师范学院曲秀春教授鉴定为百花花楸Sorbus pohuashanensis（Hance）Hedl，标本现存于牡丹江师范学院-生命学院标本室）为原料，针对常见工艺提取率低，活性成分收率不稳定，提取率指标单一，不能准确进行工艺评价——因为不同提取方法中活性成分提取率有明显差异性；同种方法，条件不同对多种活性成分的浸出也存在干扰，所以单一指标是不能准确评价工艺的。为了消除影响，有必要研究多指标工艺对参数的影响，以期为类似药物提取工艺提供一种新的评价模式。本文采用含量加权法，对总黄酮类、总萜类、多糖等指标加权，利用单因素及正交实验，研究了花楸叶活性成分提取工艺，获得较为稳定的提取工艺。

1 材料与方法

1.1.1 主要试剂

苯酚（AR）、浓硫酸（AR）、葡萄糖（AR）：沈阳试剂三厂；工业酒精（98%）、活性碳、纤维素酶（Sigma，C1794）、芦丁标准品＞99%：贵州迪大生物技术公司；甲醇（AR），三氯甲烷（AR），盐酸（AR）：沈阳试剂三厂；熊果酸标准品＞98%：贵州迪大生物技术公司；香草醛（AR）：辽宁世星药化；高氯酸（AR）等，以上未标出试剂为天津大茂化学试剂厂。

1.1.2 主要仪器

HH-6恒温水浴锅：金坛市友联仪器研究所；DZF-6020真空干燥：沈阳林频实验设备公司；FZ102植物粉碎机：天津泰斯特仪器公司；UV～2010紫外可见分光光度计（日立），PHS-25型PH计：上海雷磁；BS214D电子天平（德国赛多利斯），RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣；SL-2010N超声波萃取装置（南京顺流），索氏提取装置；NJL07-3型实验专用微波炉：南京杰全微波设备有限公司；等。

1.2 提取方法对比试验

对传统浸提法，回流提取法，索氏提取法，超声波辅助法，微波辅助法[2]，纤维素酶辅助法，并对酶法进行了适当组合。以总黄酮、多糖、萜类收率为参数指标，综合研究确定了提取方法。

具体设置参数为：将自然阴干的花楸叶，粉碎，过20～30目筛，①浸提法采用工业常用参数料液比1∶20（g/mL），70%乙醇，浸泡24 h，回收乙醇浓缩至原体积1/10，定容检测；②回流提取法：料液比1∶20（g/mL），70%乙醇，回流提取2 h，提取2次合并滤液，回收乙醇浓缩至原体积1/10，定容检测；③索氏提取同上料液比，乙醇浓度，提取6 h回收乙醇浓缩至原体积1/10定容检测；④超声波辅助法依据同样料液比，乙醇浓度，提取时间30min，温度30℃，功率100W，频率20 kHz；⑤微波辅助法：提取时间10min，功率300W，其它条件同上；⑥纤维素酶辅助法温度37℃，酶解时间0.5 h，酶添加量4mg/g，其它条件同上；⑦酶辅助复合法：具体采用酶解反应时间0.5 h，温度37℃，其它条件同上；将每组实验设置平行实验3次取平均值，结果见表1。

1.3 活性成分测定方法

1.3.1 总黄酮测定方法

采用亚硝酸钠一硝酸铝法[3]，在紫外可见分光光度计上，505 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品含量测定依据1.2方法将提取液回收乙醇，浓缩至原体积1/10，取50%乙醇定容至100mL容量瓶中，移取1mL母液于25mL比色管依据前法测定含量。

1.3.2 多糖测定方法

采用硫酸-苯酚法[4]测定多糖含量。在紫外可见分光光度计上，490 nm处测定吸光值，并绘制标准曲线。

样品含量测定依据1.2方法将提取液回收乙醇，浓缩至原体积1/10，取50%乙醇定容至100mL容量瓶中，移取2mL母液于25mL比色管依据前法测定含量。

1.3.3 萜类测定方法

此外花楸富含萜类化合物，所以将萜类化合物作为主要成分之一，采用5%香草醛～冰乙酸和高氯酸显色法[5]，在紫外可见分光光度计上，545 nm波长处测定吸光度值，并绘制标准曲线。

样品含量测定依据1.2方法将提取液回收乙醇，浓缩至原体积1/10，取50%乙醇定容至100mL容量瓶中，移取1mL母液于25mL比色管依据前法测定含量。

2 结果与讨论

2.1 提取方法对比试验结果

提取方法对比试验结果见表1。

表1 提取方法对比研究Table1 Comparative Study of Extraction

通过以上实验表明，传统的浸提法、回流提取法、索氏提取法对于大极性多糖提取效能较低，加入酶后可以提高提取率6倍以上，对于黄酮与萜类均能提高30%～50%以上，这可能与纤维素酶水解细胞壁，促进胞内物质释放密切相关。相对来说，超声波法与微波法均能较好的促进活性物质释放扩散，是较为节能又快速提取方法，相对有工艺优势。在相关萃取方法中，若采取酶先处理，将会有更大收率。通过对比，本文将以低温超声波法+酶辅助法为提取方法进行讨论，至于微波法在其它文章中讨论。

2.2 活性成分标准曲线

2.2.1 黄酮标准曲线

依据1.3.1方法建立标准曲线，芦丁对照品在（0.11～0.67）mg/mL，线性关系良好。其回归方程为Y= 0.573x+0.016 8，R2=0.999 2。

2.2.2 多糖标准曲线

依据1.3.1方法建立标准曲线，葡萄糖在（2.336～23.356）μg/mL，线性关系良好。其回归方程为Y= 0.017 5x+0.017 6，R2=0.999 3。

2.2.3 萜类标准曲线

依据1.3.3.方法建立标准曲线，熊果酸对照品在（20～100）μg/mL范围内呈良好线性关系。其回归方程为Y=0.005 5x+0.086 7，R2=0.998 4。

2.4 提取因素讨论

2.4.1 料液比的影响

将其它参数固定如：酶促温度37℃，酶促时间为1 h，添加量为4mg/g，pH为5，乙醇浓度60%，超声波温度25℃，超声波时间20min，超声波频率20 kHz，功率为200W，料液比设置如下：1∶10；1∶15；1∶20；1∶25；1∶30（g/mL），进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图1。

图1 料液比的影响Fig.1 The effect of Feedstock ratio

如图1所示，在不断提高料液比时有利于活性成分萃取，但是随着料液比增大，会对后续过滤，浓缩干燥带来更多耗能，所以料液比选在1∶20～1∶25（g/mL）范围较为合理。

2.4.2 酶添加量的影响

取5 g材料依据前面试验将料液比固定在1∶25（g/mL），酶促温度设置在37℃，酶促时间设置在1.5 h，将其它参数同上固定，设置酶添加量：8、15、20、25、30 mg。进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图2。

酶添加量往往需要决定酶促反应速度和程度，实验表明在当酶添加量达到5mg/g就可以满足以上工艺需求，同时提取液粘稠度适中过滤较快。

2.4.3 超声波时间影响

依据前面试验将料液比固定在1∶25（g/mL），酶促温度设置在37℃，酶促时间设置在1.5 h，酶添加量5mg/g，将其它参数同上固定，超声波时间：10、20、25、30、40、45min。进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图3。

图2 酶添加量影响Fig.2 The effect of enzyme concentration

图3 超声波时间影响Fig.3 The effect of Ultrasonic extraction time

据图3，在超声波萃取时间达到20min～30min中将会有一个稳定的收率，但是随着时间增加黄酮与萜类出现降低，这可能与随着时间延长多糖和其它水解糖开始团聚，会出现黄酮和萜类吸附，增加其它可能的杂质，最后影响工艺，这一点试验中采用TLC手段得到了验证，具体讨论另文介绍。

2.4.4 超声波频率的影响[6]

依据前面试验将料液比固定在1∶25（g/mL），酶促温度设置在37℃，酶促时间设置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超声波时间20min，将其它参数同上固定，超声波频率：15、20、25、30、35、40 kHz。进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图4。

图4 超声波频率的影响Fig.4 The effect of Ultrasonic frequency

超声波频率对提取产物种类有不同的影响，为了防止所需要目标产物的流逝，在以上试验中，发现低频率对于黏度大的如多糖有很好的萃取能力，对于溶液黏度小的物质适当提高频率有利于产品萃取，在本工艺中为了达到平衡所以取20 kHz下较为合理。

2.4.5 超声波功率的影响[7]

依据前面试验将料液比固定在1∶25（g/mL），酶促温度设置在37℃，酶促时间设置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超声波时间20min，超声波频率20 kHz将其它参数同上固定，超声波功率：100、200、300、400、500、600W。进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图5。

图5 超声波功率影响Fig.5 The effect of ultrasonic power

超声波功率在300W下可以较好的兼顾以上三种主要成分，大那是随着功率加大，热效应会增强，这样大分子的如淀粉纤维素会逐步进入溶剂，产生吸附，过滤时会有损失，最后影响主要成分收率，所以无论从能耗或是提取角度都应该选择较为适中功率。

2.4.6 超声波温度影响

依据前面试验将料液比固定在1∶25（g/mL），酶促温度设置在37℃，酶促时间设置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超声波时间20min，超声波频率20 kHz，超声波功率300W，将其它参数同上固定，超声波温度：30、40、50、60、70、80℃。进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图6。

图6 超声波温度影响Fig.6 The effect of Ultrasonic temperature

超声波温度有好的热扩散效应，可以促进活性成分释放[4]，但是随着温度升高，杂质将也会增加，并给过滤带来困难，所以本文提取温度60℃～70℃之间即可。

2.4.7 pH的影响

依据前面试验将料液比固定在1∶25（g/mL），酶促温度设置在37℃，酶促时间设置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超声波时间20min，超声波频率20 kHz，超声波功率300W，超声波温度70℃，将其它参数同上固定，溶液pH设置为：3、4、5、6、7、8、9。进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图7。

图7 pH的影响Fig.7 The effect of pH

提取时pH对提取产物有很大影响，同时是纤维素酶活性必须条件，如图7所示，在4～6范围内有好的收率，随着pH加大收率下降较快，这与酶最佳pH有关系，也可能与提取物质在不同pH下发生降解有一定关系。所以pH设置在3～6即可满足工艺要求。

2.4.8 乙醇浓度影响

依据前面试验将料液比固定在1∶25（g/mL），酶促温度设置在37℃，酶促时间设置在1.5 h，酶添加量5mg/g，超声波时间20min，超声波频率20 kHz，超声波功率300W，超声波温度70℃，pH4，将其它参数同上固定，萃取剂乙醇浓度为：30%、50%、60%、70%、80%。进行单因素试验，依据1.3提供的方法测定目标成分含量。其结果如图8。

图8 乙醇浓度的影响Fig.8 The effect of ethanol concentration

提取溶剂浓度对目标成分影响很大，这与极性相似相容原理统一。如图8所示由于多糖极性大，醇溶性差所以低浓度有利于其提取，但是其它成分脂溶性强，为了平衡所以取中间值，本工艺采用40%～50%乙醇浓度为萃取剂。

2.5 正交工艺优化

本试验是多指标实验，利用综合评分法将各项指标加权系数（权值）计算每号试验结果。加权系数的大小由指标的重要程度来决定，指标越重要加权系数越大[8]。本文依据其提取率多少，将多糖加权100，防止因其提取率较低，数据被抵消不能显示提取率意义。总黄酮提取率相对较高，活性相对较高若是直接对比多糖进行权值系数的话就和未加权前相似，故与萜类含量相比其权重应该在萜2倍左右较为合理所以总黄酮加权系400，萜类加权系数200。

较选取pH，超声波时间，酶加入量，乙醇浓度，料液比等为主要因素进行正交设计，选取L18（37），每组实验平行3次取平均值，采用加权综合评分，其结果如表2。

表2 正交分析结果Table2 The results of orthogonal analysis

通过R值其所选因素影响是：超声波时间＞乙醇浓度＞pH（料液比）＞酶添加量，最佳工艺条件是3，4号pH值在3～4范围内，乙醇浓度50%～60%，料液比1∶25～1∶30（g/mL），酶量5mg/g～6mg/g，工艺上相对来说3号更加符合节能降耗要求，同时由于设置权重会有一定影响，从成分平衡角度出发本文采用3号工艺参数：超声波时间25min，乙醇浓度50%，料液比1∶25， pH=4，酶添加量5mg/g。

2.6 放大实验

依据2.5将实验扩大20倍，每组重复3次，验证工艺稳定性。其结果如下表3。

表3 工艺稳定性实验Table3 Stability experim ent

通过稳定性实验放大20倍后，其重复三次实验，其黄酮提取率平均值为3.468，标准偏差2.24%，此偏差与偏离算术平均值的程度在3%以内，考虑试验误差，表明提取工艺参数较为稳定。同理其多糖、萜类偏差表明，工艺在放大20倍后有好的稳定性。

3 结论

通过对比试验数据我们可以得到酶促辅助+超声波提取技术是较为合理且能好溶剂使用量等方面有一定的优势。通过正交实验优化和综合加权分析我们可以明确对于中药提取仅仅是停留在一个主成分或浸提率上面是不能真正体现中药价值，同时实验过程中发现即使高的浸提率并不一定代表活性成分含量高。对于中药提取的理想状态是竟可能的提高活性成分，减少无用成分或有毒成分，所以很有必要针对不同药用部位开展多指标工艺优化及杂质限量控制研究。

总之,本工艺三种主要指标均比传统提取法有很大提高,放大20倍实验表明工艺较为稳定,标准偏差均在3%以内,有一定的实践指导意义。

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Optimization of Extraction Process for Active Components from Sorbus Leaves

CHAI Jun-hong，HE Ting-ting，JIN Zhi-min，MA Huai-liang，XIAO Jie，ZHANG Ping
（School of Science and Technology，Mu Dan Jiang Teachers College，Mudanjiang157011，Heilongjiang，China）

To establish simultaneous rapid extraction process for flavonoids，polysaccharides，terpene from Sorbus leaves，it is expected to be promoted to active ingredients of Sorbus leaves to provide technology-based. Sorbus leaves was used as raw material，extraction rate of the total flavonoids，polysaccharides，total terpene are technical Index；comparative study on extraction methods，using orthogonal design and comprehensive analysis of multi-index（weight）to study on the effect of the extraction process.The factors affecting the order is：ultrasonic time＞ethanol concentration＞pH（solid-liquid ratio）＞enzyme added.The Optimal process parameters：ultrasonic time was 25 min，50% ethanol concentration，the ratio of 1∶25（g/mL），pH=4，enzyme added 5 g/g.The three main Technical Index of extraction rate has more greatly improved than the traditional extraction method；the 20-times Amplification experiments show that the process was more stable；standard deviations were less than 3%.

Sorbus leaves；flavonoids；polysaccharides；terpene；optimization of process

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.007

2012-08-21

黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（项目编号：11551514）；黑龙江省教育教学改革项目，校企联合培养制药专业实用人才新模式的研究与实践

柴军红（1982—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物的分离及应用研究。