MeCP2在Rett综合征中的调控机制

杨文旭, 潘虹

北京大学第一医院实验中心, 北京 100034

DNA甲基化是表观遗传修饰的重要机制之一,是抑制性转录的标志。20世纪90年代初期, Lewis等[1]发现了一种能特异性地与 DNA序列中甲基化CpG二核苷酸结合的蛋白, 即甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2), 具有在转录水平发挥调控基因表达的作用。编码基因MECP2突变能引起 Rett综合征(Rett syndrome, OMIM 312750)。MeCP2有3个主要的功能域: CpG结合域(Methyl-CpG-binding domain, MBD)、转录抑制域(Transcription repression domain, TRD)和 C-末端域(C-terminal domain, CTD)。细胞内的 MeCP2通过MBD识别甲基化DNA并特异性地与之结合; TRD募集多种转录抑制因子, 如 sin3A和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)等形成共抑体, 抑制核小体中的组蛋白乙酰化, 从而影响染色质压缩过程, 抑制基因转录[2]。尽管MeCP2主要作为转录抑制蛋白, 但最新的研究表明其有可能具有促进基因转录的能力[3]。

1 Rett综合征

RTT是一种 X连锁的神经发育障碍性遗传病,临床主要表现为: 出生6～18个月后出现严重的精神运动发育迟缓、手的失用和刻板动作、语言发育障碍、孤独症样表现和癫痫等, 主要累及女性, 发病率约1/10000[4]。患病女性最长可存活60余年[5], 是仅次于21三体综合征引起女性、散发性严重智力障碍的主要原因之一。临床分为典型和不典型二大类:典型RTT病程分为4个期, 即发育停滞期、快速倒退期、假性静止期和运动恶化期; 不典型RTT主要有 5种类型, 即早发惊厥型、保留语言变异型、先天型、顿挫型和晚发退化型。

RTT的主要致病基因是MECP2[6], 近年在不典型RTT的早发惊厥型中发现了细胞周期依赖性激酶样 5蛋白基因(Cyclin-dependent kinase-like 5,CDKL5)和叉头框蛋白 G1基因(Forkhead box G1,FOXG1)突变[7]。MECP2突变以点突变引起的错义和

无义突变最常见[8], 8种常见的点突变分别是R106W、R133C、T158M、R168X、R255X、R270X、R294X和 R306C, 占总突变的 65%, 这些热点突变主要位于MBD和TRD两个功能域。C末端的突变主要为小缺失, 占所有突变的 10%～12%; 通过多重连接依赖的探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)方法可检测到 MECP2大片段缺失, 有全外显子及部分外显子缺失, 约占10%。此外, 复杂重排占6%[9～11]。

研究 RTT最常用的模型是基因敲除的小鼠模型[12], 不同的基因敲除方式包括: 全部敲除 Mecp2基因使其完全缺失, 如Mecp2Bird和Mecp2Jae小鼠模型; 部分敲除使 Mecp2基因部分缺失, 如Mecp2-308小鼠模型。Mecp2Bird小鼠模型由于使用了重组酶 CreloxP(Crerecombinase-loxP, CreloxP)系统明显减少了小鼠模型的致死性。小鼠模型与 RTT患者有许多相同的表现: 在解剖学水平, 部分脑区体积明显缩小, 如小脑和运动皮质层; 在细胞学水平, 神经元更加密集甚至成团, 神经元体积减少[13];突触数目减少, 树突和轴突分支形成过程减慢, 突触复杂性降低和突触形态改变。在神经递质方面,目前大部分学者认同兴奋和抑制性失衡学说[14,15],Mecp2基因敲除小鼠的部分脑区存在自发性兴奋性突触传递明显减少, 而抑制性活动明显增加, 这些变化最终导致脑区兴奋性和抑制性比率失衡[15]。在了解RTT遗传病因的基础上, 近年通过转基因技术对RTT小鼠模型进行Mecp2基因表达水平的修复实验, 发现有局部治疗的作用。但是, 过度表达Mecp2基因则与 Mecp2基因缺失相似, 均具有致病性或致死性。这些结果提示, Mecp2基因在脑内的表达量必须十分精确, 表达量过多或过少都影响其功能。

2 MECP2基因及MeCP2蛋白

2.1 MECP2基因

MECP2长约76 kb, 位于染色体Xq28, 包含4个外显子和 3个内含子, 高度保守的 3′非翻译区(3′UTR)长约8.5 kb, 可根据多聚腺苷酸位点产生3种长短不一的mRNA, 分别为1.8 kb、7.5 kb和10 kb。MECP2转录后形成MECP2-e1和MECP2-e2两种剪切体。两种剪切体分别从外显子1和2开始转录, 产生的蛋白差异位于N端序列, MeCP2-e2含486个氨基酸, MeCP2-e1含498氨基酸, 蛋白整体结构差异微小。MECP2外显子1突变可导致典型的RTT, 但突变检出率不高; 目前尚未发现外显子2突变。Kerr等[16]在Mecp2基因敲除的小鼠模型中分别通过转基因表达两种剪切体, 发现Mecp2-e1表达量越高越能改善小鼠缺乏 Mecp2所致的症状, 但是在两种剪切体表达量相同时, Mecp2-e2起到的行为改善作用更明显。另外, Mecp2-e1在脑中的表达量明显高于Mecp2-e2; 在脑区分布方面, Mecp2-e1以下丘脑居多, 而Mecp2-e2则以丘脑背侧和大脑皮层深层分布多[17]。二者作用功效、含量与密度的不一致均提示两种剪切体的功能有差异, 需要进一步的研究。

2.2 MeCP2蛋白

MeCP2蛋白有两种分子形式, 分别是 MeCP2-e1和MeCP2-e2。目前推断MeCP2单体分子量约为53 kDa, 但凝胶过滤法得到的分子量达到500 kDa。MeCP2蛋白在全身表达丰富, 中枢神经系统表达量最高, 其次是肺和脾, 这种分布特性在人类和啮齿类动物中相似。定量分析显示, 每个离体神经元核内MeCP2蛋白含量分别为核小体和甲基化CpG的1/2和1/4[18], MeCP2含量虽小却可以充分发挥调节作用。MeCP2在神经元和胶质细胞中的功能是否相同存在争议, 部分学者认同MeCP2在神经元中高表达且高效率作用这一观点[18,19]。另外, 也有研究显示神经胶质细胞中的 MeCP2作用可能不小于在神经元的作用。MeCP2在胶质细胞中的含量只有神经元中的1/5～1/4[20], 但是由于胶质细胞在树突修饰和突触形成等方面具有重要作用, 所以MeCP2在胶质细胞中的作用不可忽视。在啮齿类动物中追踪Mecp2的胚胎发育踪迹, 发现在胚胎12 d出现在脊髓和脑干中, 胚胎18 d到达大脑皮层表面。小鼠出生后Mecp2的表达高峰期在生后3～5周[18], 之后达到平台期并持续表达。

MeCP2主要的功能域是MBD和TRD。核磁共振技术显示MBD中4条β链反向平行折叠构成了楔形结构, 其内的沟型槽构成了甲基化DNA特异性的识别标志。MBD具有维持蛋白结构稳定的作用,如MECP2突变中的R133C和T158M等可通过降低MBD稳定性, 使MeCP2的功能障碍。TRD是MeCP2作为转录抑制物的主要连接域, TRD与共同抑制物sin3a和HDAC等连接后形成转录抑制复合体, 介导转录水平的负性调节功能。TRD也可连接转录因子,如YY1和CREB等产生相应的调控作用。CTD毗邻TRD, 胰岛素酶可将CTD分解为CTDα和CTDβ两个小片段, 而 CTD中最重要的 WW 域主要位于CTDα内, 此区域易连接富含脯氨酸的序列。CTD占 MeCP2总长 3/5, 可能介导染色质折叠[21], 其缺乏可引起RTT不同的表型变化。除以上几个重要域外, 还有N-末端(N-terminal domain, NTD)、核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)和间隔区(Inter domain, ID)等。这些区域的功能也尚未完全明确。MeCP2内部 60%～65%是没有特定结构的, 典型的二级结构主要集中在 MBD[22]。MeCP2单体在溶液中具有类似线圈样形态, 这种柔软的结构可能更有利于MeCP2改变构象, 适应生理条件下与多种蛋白相互作用。

2.3 MeCP2蛋白的磷酸化调节

MeCP2的丝氨酸残基磷酸化是一种重要的翻译后修饰, 分别位于S421和S80。影响磷酸化的主要因素是 Ca2+内流和神经元活性变化, 当神经元去极化时, S421被磷酸化, 而S80被去磷酸化。细胞凋亡也可以影响S80的磷酸化程度[23]。神经元去极化时,S421受 CaMKII激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII)调控, 这种磷酸化只发生在神经系统, 参与调节脑源性神经生长因子(Brain derived neurophic factor, BDNF)的表达。S80受同源结构域相互作用蛋白激酶(Homeodomaininteracting protein kinase 2, HIPK2)调节发生去磷酸化, 这种去磷酸化受MeCP2与DNA的连接紧密程度和 MeCP2对靶基因的作用程度影响。Tao等[24]研究显示转基因S80突变小鼠出现Mecp2与靶基因的连接障碍, 继而影响基因表达。两种磷酸化修饰均有助于Mecp2与靶基因的连接。

2.4 MeCP2靶基因

MeCP2作用的靶基因目前尚不完全清楚, 多个研究团队试图从RTT患者或小鼠模型的基因表达谱中找到MeCP2作用的靶基因, 但重叠的靶基因极少。编码 BDNF的基因是认可度最高的靶基因之一。BDNF具有促进神经元成熟、维持 Ca2+稳态和改善突触可塑性的功能; 与学习记忆相关。缺乏 BDNF可导致一系列神经系统异常, 若过度表达则能改善小鼠模型Mecp2缺乏引起的一些形态学缺陷。生理情况下, MeCP2与 BDNF基因的启动子Ⅳ结合, 抑制它的转录功能。当 Ca2+内流增加、神经元去极化时, 细胞内各种因子通过信号通路活化 CaMKII激酶。此激酶快速将 MeCP2磷酸化, 改变MeCP2的粘附能力和所在位置。另外, 增加的神经元活性也影响了MeCP2结合的CpG岛甲基化程度。MeCP2因而与BDNF基因启动子Ⅳ分离, BDNF表达随即增加。此外, MeCP2受BDNF的负反馈调节, 主要涉及的机制有: (1)通过 MeCP2特殊磷酸化 S357、S350和S360, 促进MeCP2与14.3.3蛋白相互作用[25], 使MeCP2从BDNF基因启动子上脱落; (2)MECP23′UTR区内的miR-132被CREB激活[26], 促进BDNF分泌, 抑制 MeCP2连接。调节 BDNF活性的还有RE1沉默转录因子(RE1-silencing transcription factor,REST)和 RE1沉默转录因子共同抑制物 1 (REST corepressor 1, COREST)[27], 当缺乏MeCP2时, 两因子连接 BDNF基因启动子Ⅰ和Ⅱ之间, 抑制 BDNF的活性。另一大类靶基因是在 3′UTR区的小分子RNA, 它们可以在 RNA 水平参与调控, 故 MeCP2可以通过这些小分子 RNA间接调控神经系统生长发育。例如miR-132参与由BDNF介导的神经轴突生长, 过度表达可降低MeCP2在脑内皮层区的表达量[26]。MeCP2可通过调控miR-184和miR-137参与细胞分化与增殖。

2.5 MeCP2蛋白与甲基化DNA连接

MeCP2的主要作用依赖DNA甲基化。DNA甲基化主要受甲基化转移酶(DNA methyltransferases,Dnmts)调控, 介导基因沉默和维持染色质结构稳定。甲基化基因沉默作用涉及 3大机制: (1)甲基化连接区变构后物理性阻碍转录因子连接; (2)募集转录抑制因子, 如sin3a等形成共同抑制复合体; (3)直接压缩染色质。MeCP2的转录抑制功能需要通过 MBD与甲基化DNA连接而发挥作用。一个分子的MeCP2覆盖甲基化DNA的11个核苷酸[28], 其中MBD占一半以上[29]。当DNA甲基化程度降低时, MeCP2在细胞核内缺乏特定的结合位点。近期有研究显示,MeCP2也可以与非甲基化 DNA连接[30]。Adams等[31]发现MeCP2中的非MBD同样有亲和并连接其他蛋白的能力, 促进MeCP2与之相互作用, 在一定程度上影响了甲基化DNA与Mecp2的亲和力。尽管MeCP2与DNA的连接方式多样化, 但是MeCP2的染色质压缩作用仍然不变。Georgel等[32]发现部分MeCP2可能直接发挥压缩染色质的作用, 不需要与甲基化DNA的连接, 提示MeCP2可能是一种染色质结构蛋白。可以推测, MeCP2在核内多个区域与DNA具有不同的连接方式。研究发现, MeCP2在核小体中轴的位置可与甲基化DNA连接, 而在近核仁的区域可与非甲基化DNA连接。另外, 在基因协同性表达时相临 DNA可形成类环状[33], 拉近不同的DNA位点, 便于各种核内蛋白的识别与连接。这种情况下, 相隔较远的 MeCP2 单体之间可以短暂接近[30], 从而间接的改变与 DNA的连接方式。此外,组蛋白H1在核内与MeCP2存在相互竞争关系, 由于其竞争能力稍逊于MeCP2, 主要起干扰MeCP2非特异性结合DNA位点的能力[28], 提高MeCP2特异结合甲基化DNA的水平。

3 结 语

MECP2是 RTT的主要致病基因, MeCP2作为DNA甲基化调控基因表达的重要转录抑制因子, 其功能异常可能直接导致下游靶基因的甲基化异常[34]。而DNA甲基化作为表观遗传的重要机制之一, 涉及神经发育、突触形成和突触可塑性等高级脑功能的调控。因此, MECP2基因突变干扰了脑的正常发育,最终导致整个神经发育网络瘫痪。RTT致病机理仍有许多未知及不同的观点[35～38], 如近期研究提出MeCP2的功能可能取决于与其协作的蛋白性质以及它的下游靶基因[39,40]。缺乏MeCP2是否一定导致不可逆性损伤？MeCP2缺乏程度在脑的局部或全脑细胞是否一致？由于超过一半的非典型RTT患儿检测不到 MECP2突变, 是否存在其他相互作用的因子,共同作用导致 RTT表型多样化？如何寻找调控MeCP2的信号通路改变其转录水平？解开这些谜团,都将为治疗及预防RTT提供新的理论依据。

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