糖调节受损大鼠认知障碍及脑组织NF-κBp65、TNF-α 的表达

董银华，王洪新，陈泽峰，魏 佳，赵 岚，李 强，范宏光

糖调节受损(impaired glucose regulation，IGR)是糖尿病前期糖调节失衡的一种表现，一般包括空腹血糖受损(impaired fasting glucose，IFG)和糖耐量受损(impaired glucose tolerance，IGT)。糖尿病是一个较早就被证实与认知功能障碍相关的因素［1］，然而糖耐量受损作为糖尿病前期的一个重要临床阶段，是否与认知功能障碍相关，至今尚无定论［2］。本研究通过建立糖调节受损大鼠模型，从炎症机制角度探讨糖调节受损与认知障碍的关系。

1 材料和方法

1.1 动物模型制备 SPF 级雄性Wistar 大鼠50 只，体重180～200 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK-(军)2007-004，随机分为对照组(NGT 组)和实验组(IGR组)，每组25 只。两组均适应性喂养1 w(不计入实验周期)，NGT 组给予普通饲料;IGR 组给予高脂高糖饲料，自由进水，室温18 ℃～22 ℃，饲养20 w。从第8 周开始，每2 w 取鼠尾静脉血进行一次葡萄糖耐量实验，空腹血糖6.2～7.5 mmol/L 或者餐后2 h 血糖7.9～10.4 mmol/L 的大鼠造模成功［3］。

1.2 行为学检测 NGT 组和IGT 组分别于第5 周、第10 周、第15 周、第20 周，采用Morris 水迷宫试验测定包括:适应性训练、定位航行实验、空间探索试验测定大鼠学习记忆能力，评定认知功能。

1.3 脑组织NF-κBp65、TNF-α 免疫组织化学检测 造模成功后，每组每个时间点随机取5 只大鼠深度麻醉后，4%多聚甲醛灌注后，断头取脑，以视交叉前缘作后作冠状位切片，行4 μm 厚的连续切片，然后依次脱水、透明、浸蜡和包埋。石蜡切片经脱蜡、水化，分别滴加第一抗体NF-κB、TNF-α，并4 ℃过夜。滴加生物素标记体，37 ℃孵育30 min。滴加过氧化物-链霉素卵白素37 ℃孵育30 min。DAB 显色，苏木素复染。目镜测微尺在200 倍视野下计数细胞，分别取大鼠脑组织连续切片10 片，每片选10 个阳性视野，计数网格中阳性细胞数，重复3 次，取其平均值。

1.4 脑组织NF-κB mRNA、TNF-α mRNA 原位杂交检测 原位杂交寡核苷酸探针试剂盒购自武汉博士德公司，用生物素标记。切片透明脱水后用0.01 mmol/L PBS 冲洗，0.2 mmol/L 盐酸室温酸化10 min，再次0.01 mmol/L PBS 冲洗后以25 μg/ml 蛋白酶K73 ℃消化10 min，并以2.5 g/L 乙酸酐平衡后，浸入90%(体积分数)乙醇脱水。切片在空气中干燥后，用2 μg/ml 的生物素标记寡核苷酸探针孵育组织(30 μl/切片)，42 ℃孵育过夜(对照:杂交反应液中不加探针，用有意义链作探针)。杂交后系列SSC 洗涤封闭，置0.3%(体积分数H2O230 min)，而后4 ℃抗生物素血清过夜，置试剂盒ABC 液室温孵育2 h，DBA 室温染色5 min，阳性反应呈棕褐色。

2 结果

2.1 糖耐量损害大鼠成模情况 高脂高糖饲料饲养10 w 大鼠成模率60%;饲养15 w 大鼠成模率100%，模型组死亡2 只，及时补充。

2.2 认知功能评定情况 第5 周IGR 组较NGT 组逃避潜伏期短，空间探索时间长，随着饲养周期的延长，糖调节损害大鼠逐渐成模;第15 周IGR 组大鼠全部成模，IGR 大鼠较NGT 组大鼠逃避潜伏期延长，空间探索穿台次数减少，实验结果有统计学差异(P＜0.05);20 w 时IGR 组与NGT 组大鼠比较学习记忆能力显著下降(P＜0.01)(见表1)。NGT 组内不同时间点比较无差别，IGR 组自10 w 以后逐渐下降，差别显著(P＜0.01)。随着饲养周期的延长，达到糖调节受损状态，大鼠的学习记忆能力明显降低。

2.3 大鼠脑 组织NF-κBp65、TNF-α 及NFκBp65mRNA、TNF-αmRNA 表达 NF-κBp65、TNF-α阳性表达为胞浆呈现棕黄色，强阳性时细胞核也出现棕黄色颗粒，胞核蓝染。采用平均灰度值比较大鼠脑组织NF-κBp65 和TNF-α 蛋白及mRNA 阳性表达水平。在第5 周IGR 组与NGT 组两因子表达无差异(P＞0.05);与NGT 组比较第10 周IGR 组NFκBp65 及mRNA 表达有差异(P＜0.05);第15 周、第20 周逐渐增高，组间差异有统计学意义;与NGT组比较第15 周IGR 组TNF-α 及TNF-α mRNA 表达有差异(P＜0.05);第20 周有显著差异(P＜0.01)，具体结果(见表2～表5)。

2.4 NF-κBp65 及TNF-α 的表达水平与认知之间的关系 Pearson 直线相关回归分析发现，IGR组大鼠学习记忆成绩与NF-κBp65 阳性表达水平呈正相关(r=0.472，P＜0.05)，与TNF-α 阳性表达水平呈正相关(r=0.475，P＜0.05)，而NGT 组两者无明显相关性(r=0.260，P＞0.05)。

表1 两组大鼠学习记忆能力(±s)

表1 两组大鼠学习记忆能力(±s)

与NGT 组比较* P＜0.05，#P＜0.01;与NGT 组内比较▽P＞0.05;IGR 组10 w 以后比较△P＜0.01

表2 两组大鼠不同时间点脑组织NF-κB 平均灰度值比较(±s)

表2 两组大鼠不同时间点脑组织NF-κB 平均灰度值比较(±s)

与NGT 组比较* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表3 两组大鼠不同时间点脑组织TNF-α 平均灰度值比较(±s)

表3 两组大鼠不同时间点脑组织TNF-α 平均灰度值比较(±s)

与NGT 组比较* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表4 两组大鼠不同时点脑组织NF-κB p65 mRNA 平均灰度值比较(±s)

表4 两组大鼠不同时点脑组织NF-κB p65 mRNA 平均灰度值比较(±s)

与NGT 组比较* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

表5 两组大鼠不同时间点脑组织TNF-α mRNA 平均灰度值比较(±s)

表5 两组大鼠不同时间点脑组织TNF-α mRNA 平均灰度值比较(±s)

与NGT 组比较* P＞0.05，#P＜0.05，▽P＜0.01

3 讨论

糖调节受损(IGR)是糖尿病前期状态，是糖尿病的高危人群。糖尿病是痴呆的高危因素已被公认。英国前瞻性糖尿病研究发现，新诊断的2 型糖尿病半数已有血管病变，提示血管病变可发生于糖尿病之前，即在IGR 阶段已经有炎性反应的发生，且可能与血管性认知障碍有关［4］。有研究报道［5］在60 岁以上老年患者人群中正常范围高血糖水平海马与杏仁核萎缩明显，认知功能减低明显。这也提示在诊断糖尿病之前高血糖水平已经对脑组织造成损害，影响老年人的认知功能。近年研究发现较多的炎性因子在胰岛素抵抗和IGR 的发生中具有重要作用，如C 反应蛋白、肿瘤坏死因子-α 等都与糖耐量损害有关［6］。

核转录因子NF-κB，在静息状态下以二聚体状态在细胞浆内与IκB 结合，激活后与IκB 解离，NFκB 核因子定位序列暴露，NF-κB 进入细胞核内，以二聚体的形式起转录调节作用，从而诱导白细胞介素-1、细胞间粘附分子、肿瘤坏死因子(TNF-α)等的表达，白细胞在各种炎性介质的介导下，向血管内皮细胞移动、粘附并渗出，参与炎症的的级联反应，最终导致缺血性神经元的损伤，另外各项因子如肿瘤坏死因子、白介素的表达反过来进一步增加NF-κB从而进一步促进炎症因子的表达，进一步加重炎症反应，形成恶性循环［7～9］。

本研究发现造模成功，第15 周后认知功能评价，糖调节受损大鼠学习记忆、能力明显迟滞于对照组大鼠，而且随着时间的延长这种趋势愈加明显;同时研究发现糖调节受损大鼠脑组织第10 周开始NFκBp65 蛋白表达NF-κBp65 mRNA 的表达均高于正常对照组，TNF-α 蛋白表达和TNF-α mRNA 的表达第15 周开始表达明显增高，两组间差异均有统计学意义，而炎症因子表达不同步的原因可能与上游NFκBp65 炎性激活的过程有关。Pearson 直线相关回归分析糖调节受损大鼠认知功能与NF-κB、TNF-α 的阳性表达水平呈正相关。

因此本研究认为炎症机制在认知障碍的发病过程中起着重要的作用，大鼠脑组织NF-κB 和TNF-α炎性因子，参与了大鼠认知功能障碍形成的过程。

综上，糖耐量受损大鼠脑组织炎性因子NF-κB、TNF-α 的表达明显高于对照组，且与大鼠认知功能障碍明显相关，本研究从炎症角度探讨了糖调节受损对大鼠认知功能障碍的影响，认为炎症机制是糖调节受损认知功能障碍的重要机制，抗炎治疗可能是防治糖调节受损认知功能障碍的重要靶点。

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［3］王 竹，杨月欣，向雪松，等.实验大鼠血糖正常范围的估算［J］.卫生研究，2010，39(2):133-142.

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［5］Lucia Kerti，Veronica Witte，Angela Winkler，et al.Higher glucose levels associated with lower memory and reducedhippocampal microstructure［J］.Neurology，2013，81:1746-1752.

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