高效液相色谱法检测黄芪黄酮类化合物研究进展*

孙念霞，陈志宏，高维娟△

(1.河北化工医药职业技术学院，河北石家庄 050026;2.承德医学院)

高效液相色谱法检测黄芪黄酮类化合物研究进展*

孙念霞1，陈志宏2，高维娟1△

(1.河北化工医药职业技术学院，河北石家庄 050026;2.承德医学院)

高效液相色谱法;黄芪;黄酮类化合物;化学成分;结构

药用黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，为历版《中国药典》收藏的上品补气药材[1]。黄芪主要含黄酮、皂苷和多糖三大类等124种化合物，其中黄酮类化合物包括异黄酮类、异黄烷类、紫檀烷类等[2]。高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)在黄芪质量控制、化学成分分析及其代谢等方面的应用日趋完善，用HPLC检测黄芪黄酮类化合物更成为热点。以下就黄芪黄酮类化合物的化学成分、结构、HPLC检测黄芪黄酮类化合物的色谱研究等做一概述。

1 黄芪黄酮类化合物化学成分和结构

1.1 黄芪黄酮类化合物化学成分 从黄芪根中分离鉴定出的黄酮类化合物的化学成分有[2-5]:芒柄花素(7-羟基-4’-甲氧基异黄酮,formonone,7-hydroxy-4’-methoxyisoflavone) (1),芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷(formononetin-7-O-β-D-glucoside)(2),毛蕊异黄酮(7,3’-二羟基-4’-甲氧基异黄酮,calycosin,7,3’-dihydroxy-4’- methoxyisoflavone)(3),毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(calycosin-7- O-β-D-glucoside)(4),5’-羟基-3’-甲氧基异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(5’-hydroxy-3’- methoxyisoflavone-7-O-β-D-glucoside) (5),7,3’-二羟基-8,4’-二甲氧基异黄酮(7,3’- dihydroxy-8,4’-dimethoxyisoflavone)(6),8,3’-二羟基-7,4’-二甲氧基异黄酮(8,3’-dihydroxy-7,4’- dimethoxyisoflavone)(7),红车轴草异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(5-hydroxycalycosin-7-O-β- D- glucoside)(8),7,2’-二羟基-3’,4’,6’-三甲氧基异黄烷(7,2’-Dihydroxy-3’,4’,6’- trimethoxyisoflavan)(9),(3R)-8,2’-二羟基-7,4’-二甲氧基异黄烷(3R-8,2’-dihydroxy-7,4’-dimethoxyisoflavan)(10)，2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷(2’-hydroxy-3’,4’- dimethoxyisoflavan)(11)，2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2’-hydroxy-3, 4’-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-glucopyranoside)(12)，7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7- O-β-D-葡萄糖苷(7,2’-dihydroxy-3’, 4’- dimethoxyisoflavan- 7-O-β-D- glucoside) (13),7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷-6’’-O-丙二酸酯(7,2’- Dihydroxy-3’,4’- dimethoxyisoflavan -7-O-β-D- glucoside- 6’ ’-O-malonate)(14),3’-羟基-2’,4’-二甲氧基异黄烷-6-O-β-D-葡萄糖苷(3’-hydroxy-2’,4’-dimethoxyisoflavan-6-O-β-D-glucoside)(15),10-羟基-3,9-二甲氧基紫檀烷(10-hydroxy-3,9-dimethoxypterocarpan) (16),9,10-二甲氧基紫檀烷-3- O- β-D-吡喃葡萄糖苷(9,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucopyranoside)(17),奥刀拉亭-7- O-β-D-吡喃葡萄糖苷(odoratin-7-O-β-D-glucopyranoside)(18)，(6aR,11aR)3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷(3-hydroxy-9,10-dimethoxypterocarpan)(19),9,10-二甲氧基紫檀烷(9,10-dimethoxypterocarpan)(20),(6aR,11aR)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(9,10- dimethoxypterocarpan-3-O-β-D- glucoside)(21),(6aR,11aR)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β- D-葡萄糖苷-6’’-O-丙二酸酯(3- hydroxy-9, 10- dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside- 6’’-O-malonate) (22),(6aR,11aR)3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-桑布双糖苷(3-hydroxy-9, 10- dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-sambubioside)(23),染料木苷(genistin)(24),染料木素(genistein) (25),槲皮素(quercetin)(26)，异鼠李素(isorhamnetin)(27),山奈酚(campherol;kaempferol)(28),异槲皮苷(isoquercitrin)(29)等。药典中规定毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪药材质量控制的指标成分之一，含量不少于0.2%。

1.2 黄芪黄酮类化合物化学结构 部分黄芪黄酮类化合物化学结构[3]，如图1-4。

图1 异黄酮类化学结构

图2 异黄烷类化学结构

图3 紫檀烷类化学结构

图4 黄酮化学结构

2 HPLC检测黄芪黄酮类化合物的研究

2.1 黄芪黄酮类化合物溶液的制备

2.1.1 黄芪黄酮类化合物的提取:影响黄芪黄酮类化合物提取的主要因素有溶剂的种类、浓度和数量，提取的时间、温度、次数和装置等。提取溶剂有乙醇、甲醇等脂溶性溶剂，乙醇的常用浓度为70%-80%，甲醇为80%，溶剂总体积为黄芪质量的10-30倍。提取方法有渗漉、回流、索氏、超声、高速剪切分散乳化等。黄芪黄酮类化合物遇热不稳定，最佳提取温度为80℃。黄芪粗粉适量浸泡1d，加10倍量70%乙醇，渗漉3天，总黄酮含量为1.84%[6]。黄芪粉末加10倍量80%甲醇，回流提取1h，重复提取3次[7]。精密称定黄芪药粉后，加入10倍量甲醇置索氏提取器中，80℃水浴提取3h[8]。黄芪药材粉末2.5g，加30ml甲醇超声30min，滤过，残渣用20ml甲醇超声20min,合并滤液[9]。以甲醇为溶剂，高速剪切分散乳化最佳条件为20倍量甲醇，转速16000r/min，提取180s[10]。渗漉法节省溶剂，但用时长。回流法效率高，但溶剂用量大。索氏法溶剂用量少，省时，但需要索氏提取器特殊装置。超声法用时更短，但溶剂用量相对大，温度不宜控制。高速剪切分散乳化法用时最少，但每次提取的黄芪生药量太少(0.2g左右)，需要高速剪切分散乳化机器。每种提取方法均有优缺点，可依据各自实验目的采取最佳方法。

2.1.2 黄芪黄酮类化合物提取液的纯化 黄芪黄酮类化合物提取液的纯化主要是把黄芪黄酮类化合物提取液中的固体颗粒、少量蛋白、色素等成分除去，以免堵塞色谱柱，影响液体相流速的均一性和稳定性。主要有沉淀、过滤、脱脂、结晶、洗涤、再溶解等方法。郑志仁等[11]将甲醇提取液减压蒸去甲醇，用乙酸乙酯分配3次，合并乙酸乙酯部分减压蒸干，重蒸甲醇定容至2ml，用0.45μm的微孔滤膜过滤。谢显珍等[8]将40目的黄芪粉末在60℃温度下干燥1h，精密称定20g黄芪药粉，加入乙醚50ml×2，超声脱脂15min，弃去乙醚液;甲醇提取液过滤并真空干燥,残留物溶解于25ml热水中，再分别用10ml和5ml正丁醇饱和液萃取2次，合并有机相，减压蒸发后用15ml甲醇溶解并过滤。纯化后的液体呈透明状，取适量液体置Eppendorf管中高速离心,取10-20μl上清液即可上色谱柱。

2.2 色谱条件 色谱条件的优化选择是HPLC研究的核心。主要包括柱型、流动相、梯度洗脱类型、柱温、检测器、对照品等的选择。郑志仁等[11]用反相色谱法测定黄芪6种黄酮类成分:Nucleosil C18柱(4.6mm×25mm,5μm),流动相为:①甲醇:水=3:2(v/v),洗脱化合物(1)、(10)、(16);②甲醇:水= 1:1(v/v),洗脱化合物(3)、(7)、(12)，室温，流速0.6 ml/min，检测波长254nm和280nm。王晓辉等[7]同时测定黄芪中的5种黄酮类成分，色谱柱:Diamonsil C18柱(200mm×4.6mm,5μm)。流动相:A:乙腈;B:水。梯度洗脱:0-25min,0.17A-0.31A;25-45min,0.35A。流速:1.0ml/min;检测波长:230nm;柱温:35℃。谢显珍等[8]用高效液相色谱条件:色谱柱为 Hypersic ODS柱(4.4mm ×250mm,5μm),流动相为:A:水(含0.015的0.03mol/ lH3PO4 ),B:乙腈。流速为1.0ml/min,线性梯度洗脱:0-5min,0.25-0.32B;5-10min,0.32-0.35B;10-20min,0.35-0.60B。检测波长:200-400nm。

综上所述，结合黄芪黄酮类化合物弱极性的特点，反相色谱法最常用。多用C18柱，流动相多用乙腈、甲酸和水的混合物，梯度洗脱，柱温30℃-35℃。紫外光度检测器和光电二极管阵列检测器最常用，检测波长多为200-400nm。依据各实验目的常用对照品，异黄酮类有(1)、(2)、(3)、(4)、(7)，异黄烷类有(10)、(11)、(12)，紫檀烷类有(16)、(17)、(20)。

2.3 色谱结果 根据反相色谱的原理可推测色谱图中各种成分出峰先后的顺序就是极性由弱到强的顺序。王晓辉等[7]的出峰先后顺序依次是(4)、(2)、(17)、(3)、(1)，含量:(4)在203.2-513.3μg/g之间，(2)在50.4-139.1μg/g之间，(17)在37.96-218.5μg/g之间，(3)在128.8-394.2μg/g之间，(1)在70.41-176.4 μg/g之间。郑志仁等[11]的出峰先后顺序是(16)、(10)、(1)、(7)、(12)、(3)。谢显珍等[8]的出峰先后顺序为(4)、(2)、(17)、(12)、(20)、(11)。HPLC可根据已知的对照品精准测出待测样品中含有的相应化学成分的种类和含量，不足是只能检测含有的已知化合物，对未知化合物只能做提示，要知道未知化合物的结构必须联合结构检测方法。

2.4 色谱指纹图谱 化学指纹图谱是从某中药材的多批次中归纳出的共性，标示某中药材或中成药特性的共有峰的图谱,反映复杂成分的中药及其制剂内在的共有成分和含量。HPLC建立的黄芪黄酮类化合物提取液色谱指纹图谱最常见于黄芪药材质量控制。李桂兰等[9]对山西浑源、应县、内蒙固阳1-5年生的黄芪建立同产地不同生长年限的指纹图谱标定了12个共有峰，通过比较发现,2-3年生之间的黄芪各组分含量较多，所以, 种植黄芪最好在2年以后、4年以前进行采收，保证黄芪的质量。

目前最常用的是高效液相/二极管阵列检测器/质谱联用方式(HPLC/DAD/MS)所得的多维指纹图谱，主要用于黄芪黄酮类化合物体内外吸收和代谢研究，研究方法有检测用药前后健康志愿者小便、鼠小便，改良的游离鼠肠翻转成囊实验，Caco-2(结肠腺癌细胞系)细胞单层模式实验，鼠肝细胞培养上清液，计算机化学预测系统等[2,12]。黄芪黄酮类化合物在脑脊液中的相关研究还未见报道，可能是因为含有细胞、各类活性因子等成分复杂，实验中的非处理因素难以控制。此类实验也未见同时有药效学研究的报道，可能是因为研究的是正常情况下的代谢，不涉及各种疾病。

3 结语

HPLC是中药现代化的重要研究工具和手段，HPLC检测黄芪黄酮类化合物的研究摆脱了单纯的方法学研究，更加注重普效学研究，标志着HPLC研究日趋成熟和完善，既有许多优点，同时也有不足。(1)相对全面:一个系统一次检测结果对于单一成分来说是全的，对于黄芪的所有组分来说又是部分的;(2)需要对照:形成的图谱中每个峰代表什么需要与对照品形成的图谱、典型图谱或是计算机化学预测系统做对比。有的不足是可以避免或消除的，因此，HPLC具有很好的应用价值。值得注意的是，在方法学中，如色谱系统的优化选择、黄芪黄酮类化合物溶液的提取等，作为基础知识不容忽视。

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R284

A

1004-6879(2014)01-0062-04

2013-10-24)

* 河北省科技支撑计划重点项目(13272504D)

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