基于清晰度的细胞显微图像分割和计数方法

王祥生WANG Xiangsheng

王 伟2WANG Wei

基于清晰度的细胞显微图像分割和计数方法

王祥生1WANG Xiangsheng

王 伟2WANG Wei

目的针对细胞显微图像分割和计数困难的问题，提出一种基于清晰度的细胞显微图像分割和计数方法。资料与方法首先对细胞显微图像进行预处理，然后对图像进行离散余弦变换，并截断高频信号部分，再与原图做差以区分清晰部分和模糊部分，结合细胞图像局部聚合度较高的特性，利用区域生长方法提取完整目标，最后进行分析和计数。结果实验结果表明，针对细胞显微图像分割和计数不准确、速度慢的问题，利用该方法分割计数的准确率＞90%，平均一幅图片的处理时间＜100 ms。结论用清晰度的方法可以快速、准确地分割细胞显微图像并进行分析计数，对快速、准确地掌握细胞个数及密度有重要意义。

细胞计数；显微摄影术；显微图像；离散余弦变换

1 方法

DCT是Ahmed等[11]于1974年提出的正交变换方法，DCT变换后信号有明确的频率特性，能量更加集中。经过DCT变换的图像高频部分表示细节，低频部分表示轮廓。通过截断DCT的高频信号部分分析图像的清晰度[12]，细胞显微图像分割[13]和计数方法实现的思路是：①将图像灰度化并用中值滤波方法去噪[14]（图1A）。②将去噪图像进行DCT变换（图1B）。③将低频信号值的一半作为阈值，截断高频信号，然后进行反DCT变换到灰度空间（图1C）。④将反DCT变换后的图像与原灰度图像求差并灰度化（图1D）。⑤用自适应阈值法[15]将步骤④中灰度化后的差值图像二值化，并用3×3的模板进行开闭运算去噪，消除离散噪声点，从而得到图像的清晰区域（图1E）。⑥利用目标在局部聚合度比较好的特性，将图像清晰区域作为初始生长区域，进行区域生长，在原始灰度图像上标记邻域灰度相似的点，如果其邻域满足公式（1），则被标记为前景点，并从该点继续生长；否则，找到下一个没有标记的生长点进行生长，直到全部标记完成，得到完整目标（图1F）。

|y1(i, j) – y1(i', j')| ＜ threshold （1）

其中，点（i，j）为当前生长点，（i'，j'）为（i，j）的八连通邻域，threshold为阈值。通常，细胞内部灰度变化较小，与背景之间存在较明显的边缘，并且当阈值取值过大时，容易造成过生长现象，因此，threshold一般设置为较小的值，通过试验，本文threshold设置为6。⑦提取的细胞内部可能存在很多空洞，同时还有一些小的孤立的噪声点，因此利用空洞填充算法[16]去除空洞及噪声点（图1G）。⑧进行连通区域标记，同时记录连通区域外接矩形坐标和连通区域面积，通过聚类的方法将细胞按面积聚成3类，其中面积远小于另外两类者被当成噪声去除（图1H）。

⑨取步骤⑧剩余的两类中面积较小的一类进行排序，将面积中值作为单个细胞面积，估计其他连通区域包含的细胞个数，最终得到总体的细胞个数。

分别运用分水岭[17,18]分割方法和本文方法进行实验，其中对分水岭方法分割后的细胞进行连通区域提取，通过分割线把粘连的细胞分开，从而对细胞计数。本文算法在计算机上采用Visual Studio 2010和OpenCV 2.4.8编程实现。

图1 对本文方法的中间结果。A为去噪后的灰度图，B为离散余弦变换，C为DCT反变换后的灰度图，D为灰度化后的差值图，E为清晰区域，F为分割结果，G为去噪并进行空洞填充，H为去除大噪声

2 结果

2.1 分割结果分析 公式（1）中，阈值的选取对分割结果的影响较大，阈值选取过小，容易出现漏标记前景的情况；反之阈值选取过大，则会出现过生长，即错标记背景为细胞，见图2。

用Photoshop软件对实验图像进行手工分割，得到符合人视觉习惯的分割作为对照，使用p=tp/（tp+fn）表示分割的准确率，其中tp表示正确分割的细胞像素，fn表示错误标记为背景的细胞像素，从而得到阈值和准确率的关系（图3）。由图3可见，区域生长的阈值＞6之后，准确率几乎没有变化，但是阈值加大会造成过生长，提高错误率，因此选取6作为生长阈值。

图2 过生长（A）和欠生长（B）的分割结果

图3 阈值和准确率的关系

2.2 计数结果分析 分水岭分割方法存在过分割和欠分割，导致计数结果与实际计数存在一定的误差，图4A中红线表示分割线。本文方法不直接分割粘连细胞，而是通过分析细胞连通区域面积进行计数，图4B中不同颜色表明本文方法对细胞的不同计数。

图4 分水岭分割方法（A）与本文方法（B）计数结果比较

另外对4种不同浓度下的细胞显微图像进行计数实验，分别采用分水岭分割计数方法和本文方法进行实验，计数结果与实际计数结果比较，误差见图5。由图5可以看出，随着细胞浓度的增大，计数结果的误差增大，主要原因在于随着细胞浓度增大，细胞之间的重叠越发明显，给分割造成更多的困难，导致算法误差加大。而本文方法误差低于分水岭分割方法。由于本文方法未直接对重叠细胞进行分割，因此消除了由于分割方法引入的误差，受细胞浓度提高造成的重叠情况影响较小，从而提高了计数准确率，使计数准确率＞90%，见表1。

试验平台为DELL Precision M6600，处理器为 Intel®Core™ i7-2960XM@2.70 GHz（8CPUs），Windows XP操作系统，试验图像分辨率为500×316像素，因为使用快速离散余弦变换方法，并且不直接分割粘连细胞图像，故在一定程度上提高了算法速度，对一帧图像进行分割、计数的平均速度为87.47 ms。对粘连图像进行分水岭分割之前，需要进行距离变换，将二值图像转换为距离灰度图像，并且当图像中细胞越多，分割算法的效率越慢，对一帧图像进行分割的平均速度为114.38 ms，见表1。

图5 分水岭分割计数方法和本文方法计数结果误差曲线比较

表1 分水岭分割计数方法和本文方法计数结果准确率比较

3 讨论

由于细胞结构形态的复杂性，目前细胞图像的分割方法受细胞粘连影响较大，无法快速、准确地分割细胞并计数。通过分水岭的方法可以分割粘连细胞，但受噪声影响较大，容易产生过分割和欠分割现象，尚无法完善解决。本文在全局范围内用清晰度区分细胞和背景，在局部用灰度信息进行区域生长提取完整细胞区域，既利用了图像局部颜色一致性的特征，又基于拍照时将焦点聚焦在细胞区域的前提，在全局通过清晰度区分细胞和背景，在一定程度上减少了误分割，结合细胞在局部聚合度较好的特性，利用局部灰度特征进行区域生长，从而达到细胞显微图像分割的目的，提高了分割准确率。在计数过程中，通过分析各个连通区域的面积，避免了粘连细胞直接分割带来的误差，并提高了算法的速度。

快速、准确地对细胞图像进行分割并得到细胞计数的方法在临床细胞计数、密度分析等方面发挥越来越重要的作用，对实际的诊断工作具有重要的辅助意义。

传统的分水岭分割方法对重叠细胞进行分割时，存在过分割和欠分割现象，计数误差较大，且随着细胞浓度增加，误差明显增大。本文应用细胞面积聚类方法对细胞重叠情况进行分类判断，实现细胞自动计数，准确率＞90%。该计数方法不直接分割重叠细胞，而是基于细胞面积的统计信息对细胞个数进行分析和判定，消除了对重叠细胞进行分割产生的误差，提高技术准确度，同时受细胞浓度的影响较小。实验结果表明，在不同浓度细胞情况下，该算法技术准确率都高于分水岭分割方法。

本文利用清晰度进行细胞显微图像分割和计数的方法具有较广阔的应用范围，其优点在于：采用清晰度在全局范围内获取细胞图像的清晰部分，再结合细胞显微图像局部聚合度较高的特性，进行区域生长，从而得到完整的细胞图像。

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（本文编辑 张春辉）

Defnition Based Cell Microscopic Image Segmentation and Counting Algorithm

PurposeTo propose a definition based algorithm for segmenting and counting cell microscopic images.Materials and MethodsCell microscopic images were first pretreated and then transformed using discrete cosine transformation (DCT). The high frequency part was truncated and re-converted to differentiate clear and blurred images. The clear foreground regions were obtained. The intact objective was extracted using region growing method. Statistics and analysis of cell number were then conducted.ResultsThis algorithm showed good performance in cell microscopic image counting with accuracy of over 90% at less than 100 ms/image.ConclusionDefinition based method is fast and accurate in cell microscopic image segmentation and counting.

Cell count; Photomicrography; Microscopic images; Discrete cosine transform

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.10.020变换（discrete cosine transform, DCT）[8-10]后低频信号部分表示图像轮廓，高频部分表示细节的特性，截断DCT高频信号，即去除图像的细节信息，然后与原图做差分，得到图像的细节信息，结合细胞图像局部聚合度较高的特征，利用区域生长方法提取完整的目标，最后进行分析和计数，从而达到对细胞显微图像的准确分割和计数，实验结果表明该算法非常有效。

1. 山东省章丘市中医医院放射科 山东章丘250200

2. 黄淮学院信息工程学院 河南驻马店463000

王 伟

College of Information Engineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000, China

Address Correspondence to: WANG Wei

E-mail: 45703557@qq.com

国家自然科学基金青年基金项目（61300065）。

Q-334

2014-06-01

修回日期：2014-09-17

中国医学影像学杂志

2014年 第22卷 第10期：797-800

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(10): 797-800

细胞结构和功能的关系研究是生物医学领域中的一项非常重要的工作[1]，而细胞显微图像的量化分析是这一研究的前提之一。与人工方法相比，显微图像处理方法在对生物图像分割及计数上更加省时、省力，并且容易实现自动化。然而由于细胞显微图像的低灰度、亮度不均匀以及细胞显微图像特有的复杂结构特性，使细胞显微图像分割和计数非常困难[2,3]。

苏茂君等[4]提出了基于脉冲耦合神经网络（PCNN）自动波特征的血细胞图像分割和计数方法，实现了对血细胞图像的准确计数和特定细胞的单独分割，但对于2个相邻重叠的血细胞计数不太准确，而且不适用于相邻联系紧密、形状特殊的植物细胞图像。武宗茜等[5]提出基于活动轮廓模型的重叠藻细胞自动计数方法，不直接分割重叠细胞，消除了重叠细胞直接分割带来的误差，计数准确率高于90%。任亚恒等[6]提出一种基于改进的Ostu法对大鼠精子图像进行分割，可以实现精子图像的快速准确分割，并自动统计精子个数，但受精子粘连的影响较大。

由于细胞结构形态的复杂性[7]，不同的方法适用于特定细胞图像的分割。采集细胞显微图像时，通常将焦点对准细胞，而背景处于离焦状态。本研究通过对显微图像的清晰度进行研究，提出一种基于清晰度的细胞显微图像分割和计数方法，其中清晰度指影像上各细部影纹及其边界的清晰程度。该方法利用图像经过离散余弦