鳗弧菌对魁蚶血细胞形态及免疫功能的影响*

周丽青 杨爱国① 王清印 吕振明 刘志鸿 田吉腾 吴 彪

(1．中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 青岛 266071;2． 浙江海洋学院 舟山 316000)

商品规格魁蚶(Scapharca broughtonii)或鲜食,或加工为干制品,肉质鲜美,营养丰富。20世纪以前,我国魁蚶野生资源丰富,但常年的滥采乱捕和环境污染,导致该贝野生资源骤减,虽然它的人工育苗及养成研究早有成功范例,但一直都不属于主流养殖物种。近年来,因适应性强、生态修复效果显著的特点,魁蚶人工养殖发展迅猛,为防止发生类似于扇贝、鲍鱼和牡蛎等长期单一品种高密度养殖模式下,水质恶化、养殖品种生长缓慢和病害暴发,我们开展了魁蚶种质资源和遗传多样性(吴彪等,2012;梁超等,2010,2011;周丽青等,2012;Tianet al,2012)、生长(吴彪等,2012)、血细胞类型(周丽青等,2013)及形态选育指标(吴彪等,2010)等良种培育的研究,发现魁蚶对致病弧菌的抵抗能力强,具有很高的抗逆性能,为培育魁蚶抗病抗逆新品系,作者观察鳗弧菌(Vibrio anguillarum)免疫刺激前后血细胞形态变化及相应的免疫功能,以期为魁蚶种质改良积累免疫参数。

1 材料和方法

1.1 实验动物

18只3龄健康魁蚶购自山东青岛南山水产品市场,壳长 70—80mm,体重 110—150g。水温 18—22°C 暂养1周左右,投喂硅藻、扁藻和金藻,每天换水1次。

1.2 鳗弧菌免疫刺激魁蚶血细胞

鳗弧菌菌种由中国海洋大学海洋生命学院提供,2611E海水培养基培养。魁蚶3只一组,采用一次性1ml注射器斧足注射 1×109个/ml鳗弧菌生理盐水溶液0.1ml,3只不注射的作为健康对照组,分别于注射3—4h,6—10h,12—16h,24—30h和48h后取血淋巴液。

1.3 血细胞分类和形态观察

血淋巴液制片方法参照刘志鸿等(2003)。前闭壳肌血窦中抽取血淋巴液,选Alserver液(18.7g/L葡萄糖,8g/L柠檬酸三钠,0.5g/L柠檬酸,4.2g/L NaCl)和MAS液(20.8g/L葡萄糖,8g/L柠檬酸三钠,3.36g/L 乙二胺四乙酸二钠;22.5g/L NaCl)为抗凝剂。制备的血涂片用南京建成科技有限公司快速瑞氏-吉姆萨染液染色,LeicaDM4000B光学显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 红细胞形态变化及其免疫功能

魁蚶红细胞在显微镜下呈中间厚边缘薄圆形或椭圆形饼状,胞质中黑色颗粒推测为血红蛋白颗粒;经鳗弧菌免疫刺激后,红细胞常现无丝分裂和不等缢裂(见图1),注射12h后更多见,图1a为红细胞吞噬或胞吐血红蛋白颗粒;图1b为刚完成分裂的红细胞,血红蛋白近乎平分;有时细胞核不等缢裂(图1c),有时细胞分裂为大小不等2个(图1d);有的细胞核不分裂,胞质缢裂球中无细胞核,血红蛋白颗粒不等分配(图1e,图1f),具细胞核的小分裂球有时小至5μm左右(图1g),有些小分裂球中不含血红蛋白颗粒(图1h)。红细胞在 2种抗凝剂及无抗凝剂的血淋巴液中的形态无明显差异。

图1 魁蚶红细胞的无丝分裂和缢裂Fig.1 The amitosis and strangling division of red cells in hemolymph of Scapharca broughtonii

魁蚶红细胞对侵入血淋巴液的病原菌有吞噬作用,病原菌首先黏附在近旁的红细胞膜上(图2a),红细胞吞噬病菌并形成包囊(图2b),吞噬病原菌的部位常以缢裂方式从细胞母体中分离出来(图2c,图2d,图2e);注射24h后,被吞噬的鳗弧菌以吞噬泡的形式悬挂于细胞膜表面(图2f);注射12h之前,红细胞表面对病原菌有明显的免疫吸附功能,注射3—4h后即可见个别红细胞表面吸附大量病原菌(图2g),随着血淋巴液中病原菌被吞噬减少,很少见红细胞表面吸附病原菌,制片过程可能会使细胞表面免疫吸附的病原菌脱落,细胞表面呈现白色空洞(图2h)。

2.2 白细胞形态变化及其免疫功能

白细胞在抗菌免疫中起着极其重要的作用,注射病原菌12h后白细胞数目明显增多。嗜碱性细胞吞噬大颗粒异物(图3a);嗜酸性和嗜中性细胞则是吞噬病原菌的主力,白细胞之间易粘连,尤其 MAS液中,发生吞噬作用的白细胞易相互粘连甚至融合(图3b),白细胞间的粘连常参与血栓的形成;被白细胞吞噬的病原菌不能立即被消化分解,它们在白细胞内仍能存活一段时间,并企图从白细胞中挣脱出来,致使细胞表面形成各种不规则突起(图3c);白细胞具有变形运动能力(图3d),可移动到病原菌附近实施吞噬;注射24h后,病原菌被白细胞消化分解后呈细丝状或液化,消化泡从白细胞中缢裂出来,游离于血淋巴液中(图3e);白细胞也有免疫吸附作用,可吸附并快速吞噬大量病原菌(图3f,图3g);白细胞中的淋巴细胞一般不具备吞噬病原菌的作用,可能会向血液中分泌抗体,淋巴细胞核常见有缺刻(图3h)。

图2 魁蚶红细胞对病原菌的免疫作用Fig.2 The immune function for pathogen of red cells in hemolymph of Scapharca broughtonii

图3 白细胞形态变化及其吞噬作用Fig.3 The morphological change of white cells and their phagocytic function

2.3 血栓细胞形态变化及其功能

正常情况下血栓细胞呈长梭形,细胞核呈圆梭形(图4a),未抗凝或注射病原菌后,血栓细胞之间容易相互粘连(图4b),注射病原菌3—4h后,血淋巴液中游离的血栓细胞数量急剧减少,且形态变得极不规则,多已参与凝血。血栓细胞启动凝血机制时细胞膜边缘不清晰,细胞核周围出现大量细丝状物质类似不溶性纤维蛋白(图4c),逐渐弥散开来;血栓细胞间相互交织粘连(图4d),纤维蛋白弥散交织后,有些细胞核会略有变形,逐渐增多的纤维蛋白交织成网后网住周围的血细胞形成血栓块(图4e);血栓细胞偶尔黏附或吞噬病菌(图4b,图4f)。注射病原菌后,MAS液中,血栓细胞形态相对正常(图4a,图4b),Alserver液中血栓细胞的形态常发生改变,细胞核形态膨胀弥散开来(图4c,图4d,图4e)。

图4 血栓细胞形态变化Fig.4 The morphological change of thrombocytes

3 讨论

3.1 血细胞的无丝分裂和缢裂

无丝分裂(amitosis)又称直接分裂,动物血细胞的无丝分裂存在以下4种情形:(1)细胞物质代谢旺盛,通过无丝分裂增大细胞核的表面积;(2)已分化细胞中无丝分裂多见;(3)不良环境与老化导致细胞发生无丝分裂;(4)组织再生时,细胞的无丝分裂会增多(张警愚,1989)。在本研究中,注射病原菌 12h以后,红细胞无丝分裂和缢裂现象增多;注射24h之后,白细胞缢裂增多,说明不同血细胞分裂功能不同,红细胞的无丝分裂是为了增加运输氧气,增强机体抵抗病菌入侵的能力,同时补充因为吞噬病原菌而死亡的红细胞数目;白细胞的缢裂可能是为了减少负担,以便继续吞噬病菌。邹拓谜等(2011)认为多倍体的野生鲫(Carassius auratus)通过血细胞的无丝分裂来增加细胞数量,保证其总血红蛋白含量相对稳定,从而确保它们运输氧气的能力。胡知渊等(2005)推测较多的红细胞数量会刺激棘胸蛙(Pana spinosa)红细胞的无丝分裂。罗芬等(2010)认为疫苗能够诱导中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensisBleeker)外周血红细胞、单核细胞和中性粒细胞等具有吞噬功能的细胞数量增加,来增强其吞噬功能。注射12h后,魁蚶白细胞数目明显增多,但未观察到白细胞分裂增生的过程,这是因为血细胞起源于造血干细胞,而单纯的形态学方法难以辨认造血干细胞(李长玲等,2009)。

3.2 魁蚶血细胞对病原菌的免疫功能

魁蚶血淋巴液中 3大类细胞在受到鳗弧菌免疫刺激后都发生形态改变,笔者认为属于免疫防御的应激反应。多数研究人员认为吞噬作用主要由粒细胞完成(Carballalet al,1997;Moore,1972;李太武等,2007),魁蚶的红细胞、各种白细胞和血栓细胞都具有吞噬病原菌的功能,红细胞先表现出免疫黏附功能,与魏静等(2010)和张振冬等(2006)对鱼类红细胞免疫黏附功能的研究结果一致;注射鳗弧菌一段时间后,魁蚶红细胞又表现一定的病原菌吞噬功能;白细胞是吞噬病原菌的主力军,血栓细胞偶有吞噬病原菌作用,且注射病原菌后,二者共同参与血液的凝固过程。Burrows等(2001)观察发现大菱鲆(Psetta maxima)血栓细胞除具有凝血功能外,还具有吞噬功能;路卫星等(2008)观察的几种变温脊椎动物血栓细胞形态及功能与魁蚶的较为一致;绿海龟(Chelonia mydas)的血栓细胞细胞质边界模糊的特性也与魁蚶的较为相似;贝类中除朱泽闻等(2011)和张维翥等(2005)推测存在特化的血栓细胞起凝集作用外,尚未见有血栓细胞的报道。本研究发现,魁蚶血细胞分工明确,能共同防御病原菌的入侵,细胞免疫对病原菌免疫防御起极其重要的作用,是否存在体液免疫或体液和细胞共同免疫有待进一步研究。今后可借鉴王日昕等(2009)构建的高质量血细胞 cDNA文库进行 Expressed sequence tag(EST)序列分析,深入研究魁蚶免疫相关因子和免疫机制。

3.3 2种抗凝剂对魁蚶血细胞形态的影响

Hindriks等(1992)认为血栓细胞形态变化受外界无机离子浓度影响较大,本研究发现 Alserver液和MAS液对阻止血液凝固都有一定的作用,Alserver液中血栓细胞易变形,细胞边缘不清晰,MAS液中,血栓细胞形态轮廓光滑可辨;相反,Alserver液中白细胞之间不粘连,细胞外形圆滑;MAS液中,白细胞之间易粘连,甚至融合,且细胞外形不圆润,常有各种形状突起。估计这2种抗凝剂改变了参与凝血的血细胞表面粘连特性,使血液无法凝固,因而起到抗凝作用。蒋琼等(2001)筛选中国对虾(Penaeus chinesis)血淋巴抗凝剂时,以能够良好保持细胞的整体形态以及细胞器、细胞核形态为标尺。因此,研究魁蚶血细胞形态及免疫功能需选择合适的抗凝剂。

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