高效液相色谱法测定紫苏中5 种有机酸和黄酮的含量

秦红英，周光明*，彭贵龙，李俊平

（西南大学化学化工学院，发光与实时分析教育部重点实验室，重庆 400715）

高效液相色谱法测定紫苏中5 种有机酸和黄酮的含量

秦红英，周光明*，彭贵龙，李俊平

（西南大学化学化工学院，发光与实时分析教育部重点实验室，重庆 400715）

目的：建立以甲醇溶液为萃取剂，结合超声辅助萃取，利用高效液相色谱法同时分离测定紫苏中的咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 种有效成分的方法。方法：采用Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%冰醋酸溶液，采用梯度洗脱程序；流速1 mL/min；紫外检测波长320 nm；柱温35 ℃。结果：该方法对咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素分别在0.001 22～61.00（r=0.999 99）、0.001 06～53.00（r=0.999 99）、0.001 28～64.00（r=0.999 91）、0.001 20～60.00（r=0.999 94）、0.001 12～56.00 μg/mL（r=0.999 95）范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.999 91，检出限（RSN=3）依次是：0.101 9、0.392 6、0.355 9、0.286 2、0.202 5 ng/mL；样品回收率为95.79%～101.41%。结论：本法操作简单快速、定量准确、灵敏度高、成本低、且对环境友好，为紫苏中咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的分离检测提供了一个有效的方法。

黄酮；有机酸；超声辅助萃取；高效液相色谱法；紫苏

紫苏（Perilla frutescens）为唇形科紫苏属（Perilla frutescens (L.) Britton）植物紫苏全草，又名白苏、赤苏等，气清香，味微辛，具有止咳平喘、解表散寒、行气和胃、理气宽中、止痛安胎等功效，主要用于痰壅气逆、咳嗽呕恶、风寒感冒、妊娠呕吐、胃脘疼痛、胸膈痞闷、鱼蟹中毒等病症[1]。现代药理学研究证明，紫苏是一种极具营养价值的保健资源[2]，主要含有黄酮类化合物、迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等多种生物活性成分[3-5]，具有良好的抗氧化[6-7]、抗癌[8]、抗炎[9]、抗菌[10]、抗过敏、保肝[11-12]、降血脂[13]、调节血糖[14]等药理作用。目前虽已有紫苏中相关活性成分的测定研究报道，如Chen等[15]报道了高效液相色谱法分析紫苏中的三萜类化合物的方法，马尧等[16]报道了紫外分光光度法测定紫苏中总黄酮含量的方法，黄亮辉等[17]报道了高速逆流色谱分离纯化紫苏叶中迷迭香酸的方法；但同时分离测定紫苏中有机酸和黄酮的方法尚未见报道，本研究采用超声辅助萃取及高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法分离同时测定了紫苏中咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 种有效成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏原药材（经西南大学周光明教授鉴定） 当地药房；咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素对照品（纯度均≥99%） 上海晶纯实业有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（纯度≥99%） 中国科学院兰州化学物理研究所；甲醇、乙醇、冰醋酸（均为分析纯） 重庆川东化工有限公司化学试剂厂；磷酸（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

LC-20AT液相色谱输液泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-Solution色谱数据处理系统 日本岛津公司；KH-3200B型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司；TGL-16G高速离心机 上海安亭科学仪器厂；SZ-2自动双重纯化水蒸馏器 上海泸西分析仪器厂有限公司；LIDA pH计 上海理达仪器厂；FA2004A型分析天平 上海精天电子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为体积分数0.1%冰醋酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～5 min，45%～53% B；5～10 min，53%～55% B；10～15 min，55%～60% B；15～20 min，60%～45% B。流速1 mL/min；进样量20 μL；检测波长320 nm；柱温35 ℃。

1.3.2 对照品溶液的配制

对照品溶液的制备：分别精密称取咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素对照品适量，甲醇溶解，分别配制成610 μg/mL咖啡酸、530 μg/mL阿魏酸、640 μg/mL迷迭香酸、600 μg/mL木犀草素、560 μg/mL芹菜素的溶液对照品储备液，避光保存，待用。

混合对照品溶液：分别准确吸取3 种对照品储备液适量，用流动相配制成一系列不同质量浓度的混合对照品溶液，置于冰箱（4 ℃）内避光保存备用。

1.3.3 供试品溶液的制备

将紫苏于60 ℃干燥至恒质量后粉碎，过60 目筛（0.5～1.2 mm），干燥条件下保存备用。准确称取0.1 g紫苏粉末，加入10 mL甲醇，浸泡4 h，超声萃取30 min，过滤取滤液，离心10 min（3 500 r/min），取上清液经0.45 μm有机滤膜过滤，进样分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

为选择最佳的检测条件，本实验比较了CH3OHH2O、CH3OH-CH3COOH、CH3CN-CH3COOH，CH3CNH3PO4体系对5 种目标分析物的分离效果。当流动相为CH3OH-H2O体系时，调节流动相比例，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸3 种组分峰不能完全分离，且木犀草素、芹菜素2 种组分峰拖尾严重。当流动相为CH3OH-CH3COOH时，在合适的梯度条件下，5 种目标物出峰时间适宜，分离度良好，且峰形对称性好。在以CH3CN-CH3COOH、CH3CN-H3PO4为流动相时，不断改变梯度条件，5 种组分峰峰形和分离度均未有较大改善，且CH3CN毒性远大于甲醇，而H3PO4易损坏色谱柱，故选择CH3OHCH3COOH体系为流动相。在色谱柱允许的pH值范围内，考察了醋酸比例对峰形的影响，当醋酸比例为0.1%时，峰形最佳，分离度均大于2.0（图1），故最终选择CH3OH-0.1% CH3COOH体系为流动相。

图1 混合对照品溶液HPLC图Fig.1 Chromatogram of standard solution mixture

2.2 提取溶剂的选择

为了选择合适的提取剂提高萃取率，本实验分别采用离子液体[BMIm]PF6、[OMIm]PF6、[HMIm]PF6以及甲醇、乙醇溶液为提取剂，在相同萃取条件下比较对目标分析物的提取效果。结果表明，以乙醇和离子液体为萃取剂时，5 种目标分析物的提取率下降，且离子液体会影响HPLC分析时的分离度；当以甲醇溶液作为提取剂时，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的提取率均明显提高。故本实验最终采用甲醇溶液作为萃取剂。此外，本实验还考察了不同浸泡时间对提取效果的影响，通过浸泡不同时间后提取分析比较，表明浸泡4 h提取效果最佳。

2.3 固液比的选择

为了得到最佳的提取效果，本实验考察不同的固液比对提取率的影响。固液比分别为1∶20、1∶30、1∶50、1∶80、1∶100（g/mL）时，当固液比为1∶80（g/mL）时5 种目标分析物的提取率显著提高，因此，本实验以1∶80（g/mL）为最佳固液比（图2）。

图2 紫苏供试品溶液HPLC图Fig.2 Chromatogram of Perilla frutescens sample

2.4 线性关系的考察

分别精密量取1.3.2节混合对照品溶液，用甲醇稀释至不同质量浓度。从低质量浓度到高质量浓度，依次进样，每个质量浓度进样3 次，每次20 μL，按1.3.1节色谱条件进行HPLC分析，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归。回归方程、相关系数和线性范围见表1。

表1 线性关系实验结果（n=3）Table 1 Regression equations, linear ranges and LODs (n=3)

2.5 精密度实验

精密吸取咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的质量浓度分别为12.2、10.6、12.8、12.0、11.2 μg/mL的对照品混合液20 μL，按照1.3.1节色谱条件进行HPLC分析。重复进样6 次，测定各个对照品的峰面积，结果咖啡酸峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.05%，阿魏酸峰面积RSD为1.32%，迷迭香酸峰面积RSD为1.84%，木犀草素峰面积RSD为1.72%，芹菜素峰面积RSD为1.33%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

精密吸取1.3.3节供试品溶液20 μL，在避光条件下，于0、4、8、12、16、20、24、48 h分别进样，测定咖啡酸的峰面积RSD为0.97%，阿魏酸的峰面积RSD为1.72%，迷迭香酸的峰面积RSD为1.68%，木犀草素的峰面积RSD为1.79%，芹菜素的峰面积RSD为1.29%，表明该方法稳定性良好。

2.7 重复性实验

精密称取同一批紫苏样品6 份，按照1.3.3节方法制备，1.3.1节色谱条件测定。结果咖啡酸峰面积RSD为1.34%，阿魏酸峰面积RSD为2.25%，迷迭香酸峰面积RSD为1.18%，木犀草素峰面积RSD为1.96%，芹菜素峰面积RSD为2.48%，表明该方法重复性良好。

2.8 回收率实验

精密称取已知含量的同一批紫苏样品0.1 g 9 份，分成3 组，每组按照低、中、高3 个标准准确加入对照品混合液，按1.3.3节方法制备，1.3.1节色谱条件测定。咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素的回收率测定结果，见表2。

表2 回收率实验结果Table 2 Recoveries of five compounds in spiked samples

2.9 样品含量的测定

取同一批紫苏样品3 份，按照1.3.3节方法制备，1.3.1节色谱条件测定，样品含量测定结果见表3。记录紫苏样品色谱图，见图2。

表3 样品含量测定结果 (n=3）Table 3 Results of determination of samples (n=3）

3 结 论

3.1 本实验采用分析纯的甲醇作为流动相，与使用色谱纯的甲醇作流动相的文献报道相比，目标分析物峰形良好，且无杂质干扰峰，大大降低了实验研究成本。

3.2 为了选择合适的流动相体系，本实验选择了CH3OH-H2O、CH3OH-CH3COOH、CH3CN-CH3COOH、CH3CN-H3PO44 种流动相体系对5 种目标分析物的分离效果进行比较。在不断调节流动相比例的前提下，以CH3OH-H2O为流动相时，咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸3 种组分峰不能完全分离，且木犀草素、芹菜素2 种组分峰拖尾严重；而其他3 种流动相体系在合适的梯度条件下，5 种目标分析物分析时间短，且分离度均达到2.0以上，但乙腈比甲醇的毒性和成本更高，而磷酸对色谱柱的损害较大，故最终选择CH3OH-CH3COOH作流动相。黄亮辉等[18]在对不同采收期的紫苏叶和白苏叶中迷迭香酸的含量研究中，采用了甲醇-0.1%磷酸水溶液作流动相，迷迭香酸出峰时间在25 min左右，而本实验中5 种目标分析物的出峰时间均在16 min以内。

3.3 由于目标分析物易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂及溶解性能良好的离子液体，本实验分别采用离子液体[BMIm]PF6、[OMIm]PF6、[HMIm]PF6以及甲醇、乙醇溶液为提取剂，在相同萃取条件下比较对目标分析物的提取效果，与以甲醇作萃取剂相比，以离子液体为萃取剂时，5 种目标分析物的提取率明显降低，且离子液体黏度太大不利于色谱分析；以乙醇作萃取剂，虽然能够降低毒性，但5 种目标分析物的总提取率显著低于甲醇，故最终采用甲醇作萃取剂。与荣维燕等[19]用乙醇超声辅助提取紫苏叶黄酮的研究相比，本实验中总黄酮提取率更高，并有效提取了紫苏中的有机酸。

3.4 相关紫苏中有机酸和黄酮的文献报道不一，如张蕾蕾等[20]采用微波法提取测定紫苏中的黄酮，亦有采用HPLC测定紫苏中有机酸的含量[21]，但鲜有关于紫苏中咖啡酸、阿魏酸、芹菜素的报道，且尚未有对于紫苏中黄酮和有机酸的同时分离测定。本实验建立了以甲醇溶液为萃取剂，结合超声辅助萃取，利用HPLC同时分离测定紫苏中的咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、木犀草素和芹菜素5 种有效成分的方法。在优化的最佳实验条件下，5 种目标成分萃取率高，分离完全。该方法操作简便、检出限低、定量准确，为紫苏的有效成分的质量评价和控制提供了科学依据。

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Determination of Five Organic Acids and Flavonoids in Perilla frutescens by High Performance Liquid Chromatography

QIN Hong-ying, ZHOU Guang-ming*, PENG Gui-long, LI Jun-ping
(Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis, Ministry of Education, College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective: A simple high performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for the simultaneous quantif i cation of caffeic acid, ferulic acid, rosmarinic acid, luteolin and apigenin from Perilla frutescens using methanol as extractant with ultrasonic-assisted extraction. Methods: The fi ve compounds were isolated by using a Phenomenex C18column by gradient elution, and the mobile phase was methanol-0.1% acetic acid solution with a fl ow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength was performed at 320 nm. Results: The linear ranges for caffeic acid, ferulic acid, rosmarinic acid, luteolin and apigenin were determined to be 0.001 22-61.00, 0.001 06-53.00, 0.001 28-64.00, 0.001 20-60.00 and 0.001 12-56.00 μg/mL, respectively, and the correlation coeff i cients were 0.999 99, 0.999 99, 0.999 91, 0.999 94 and 0.999 95, respectively. The limits of detection (LOD) were 0.101 9, 0.392 6, 0.355 9, 0.286 2 and 0.202 5 ng/mL, respectively. The average recoveries of these compounds in spiked real samples were in the range of 95.79%-101.41%. Conclusion: The proposed method is simple, precise, specif i c, sensitive and accurate. It provides a new and scientif i c means for routine quality control of Perilla frutescens.

organic acids; fl avonoids; ultrasonic-assisted extraction; high performance liquid chromatography; Perilla frutescens

O652.62

A

1002-6630（2014）14-0102-04

10.7506/spkx1002-6630-201414020

2013-10-10

国家自然科学基金面上项目（21277110）

秦红英（1989—），女，硕士研究生，研究方向为色谱分析。E-mail：qinruobing@sina.cn

*通信作者：周光明（1964—），男，教授，博士，研究方向为色谱及其联用技术。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn