一种基于干扰肌动蛋白基因导致方形网纹溞(Ceriodaphnia quadrangula)死亡的RNA干扰(RNAi)模型构建*

陈宏健 谢 松, 李理想 柳峰松,①

(1.河北大学生命科学学院 保定 071002;2.河北省无脊椎动物系统学与应用实验室 保定 071002)

枝角类是一种小型水生浮游动物,多数为淡水种,少数海水种,是鱼类的天然饵料之一。由于其形体较小、生长周期短、繁殖速度快、敏感性高,1984年美国 Mount和 Norberg率先利用模糊网纹溞(Ceriodaphnia dubia)进行毒性实验后,国内外研究人员已经将其发展成为研究病理毒理的重要实验动物(Koivisto,1995;Sarmaet al,2003;Komjarovaet al,2009;Thanhet al,2010)。另外,鉴于枝角类所特有的诸多优点,它也是研究水生动物基因功能的良好材料。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指通过双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)特异性地抑制靶基因转录后表达的现象,通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的 dsRNA,诱导内源靶基因mRNA降解,达到抑制基因表达的目的(Gheysenet al,2007;La Fauceet al,2009)。RNAi技术已发展成为了基因功能研究的重要手段。目前以化学合成 siRNA(Small interfering RNA),并以注射、投喂等方法对生物体内内源基因进行干扰最为常见(Shan,2010)。但化学合成siRNA的方法价格相对昂贵。近年来,研究者开始致力于采用构建 RNA干扰载体,并用细菌表达dsRNA的方法来进行RNAi实验,这种方法的优点是价格低廉,并一次能表达出大量的dsRNA,但在实验的稳定性和特异性方面有待进一步实验验证。

肌动蛋白(actin)普遍存在于真核生物,是构成细胞骨架的主要蛋白之一,可分为α、β、γ三种类型。actin的保守性很高,并且在各个发育时期的表达量十分稳定,因而β-actin常作为基因定量的内参之一。由于 actin具有上述特点,故十分适合于研究并在构建物种RNAi模型时使用。

本研究中的材料为方形网纹溞,属枝角目,溞科,网纹溞属。庄德辉曾对其毒理(庄德辉,1996)及生物学(庄德辉,1994)方面做了相关的研究,因此方形网纹溞的生长和繁殖等方面相对清楚。本研究的目的在于以方形网纹溞actin基因为目标,得到其序列,构建其RNAi模型,探讨枝角类等水生生物基因功能与表达规律。

1 材料与方法

1.1 材料

2011年 9月在河北保定护城河东风路段捞取混合溞类,而后对方形网纹溞进行纯培养。方法是取一只怀卵的方形网纹溞的孤雌生殖雌体进行培养,在其所产生的子代中挑选一只个体大,繁殖量多的雌体进行后续培养,之后所产生的子代即为纯种。

1.2 主要试剂与质粒菌种

RNAiso Plus、pMD-19T simple vector、T4 连接酶、限制性内切酶、SYBR Green为Takara公司产品;Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒为康为世纪生物科技有限公司产品;引物及测序由南京金斯瑞科技有限公司完成。L4440质粒和大肠杆菌 HT115菌种由河北大学生命科学学院李继刚博士惠赠。

1.3 方形网纹溞总RNA的提取与反转录

将100只方形网纹溞置于离心管中,加入RNAiso Plus研磨,依照说明书提取总RNA。经琼脂糖凝胶电泳和UV检测和定量后,取1μg总RNA,以AOLP(序列见表1)为引物反转录合成cDNA。

1.4 方形网纹溞actin部分cDNA序列的克隆

根据National Center of Biotechnology Information(NCBI) 网 站 上 大 型溞(Daphnia magna)的actin(GenBank登录号为AJ292554.1)的mRNA序列设计引物ACT-F1和ACT-R1(表1)。PCR扩增,反应程序为:94°C预变性3 min;94°C变性30s,55°C退火30s,72°C延伸90s,35个循环;最后72°C延伸10min。电泳分离PCR产物并回收目的片段,连入T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆后提取质粒测序。

1.5 actin的RNA干扰载体Actin-L4440的构建

根据测序得到的actin基因部分cDNA序列,设计一对引物cACT-LF和cACT-LR(表1),引物5′末端分别引入BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切位点。PCR扩增得到片段,电泳回收后用BamHⅠ和XhoⅠ对其进行双酶切,并连入L4440质粒,构建actin RNAi载体Actin-L4440。连接产物转入大肠杆菌 DH5α感受态细胞中,菌落PCR筛选阳性克隆,扩大培养后提取质粒测序验证。

1.6 dsRNA的诱导表达

用Actin-L4440质粒转化大肠杆菌HT115感受态细胞,同时以空载L4440质粒作为阴性对照。选取阳性克隆,在含有氨苄青霉素、四环素的液体LB培养基中于37°C,200 r/min摇菌培养至OD600达0.8,加入(IPTG)至终浓度为0.8mmol/L诱导5h。12000r/min离心2min收集菌体,并利用RNAiso Plus提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的表达情况。

1.7 细菌介导RNA干扰

取上述诱导后转入重组质粒 Actin-L4440的HT115菌液 200mL,离心收集菌体后用 100mL去离子水(dH2O)重悬,并以每组1mL分装于试管中。同时,采用转入L4440空载质粒的大肠杆菌HT115作为实验对照,以同样的方法进行。以60只/组的方形网纹溞(5龄,即2龄成体)加入经诱导的Actin-L4440-HT115菌液以及对照 L4440-HT115菌液中(RNAi组与对照组分别设置多组重复,以满足后续实验的要求)。浸泡12h后分别提取总 RNA,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,用Real-Time PCR方法对actin的表达进行定量分析,以确定 RNAi效果,数据处理采用 2−ΔΔCT法(Livaket al,2001)以及 SPSS17.0 统计软件的单因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)的方法进行。当尾概率P>0.05时,各组数据之间无差异;0.01

表1 实验所用引物Tab.1 Primers used in experiments

2 结果

2.1 目的基因actin的部分克隆

根据近缘物种 actin基因序列设计同源引物,从方形网纹溞中克隆得到其 actin cDNA片段序列,长度为858 bp的序列(见图1),全部为编码序列,提交序列至 NCBI,GenBank登录号为 JX442202。利用NCBI网站的Blastn程序比对发现(见图2),此序列与大型溞D.magna(GenBank:AJ292554.1)、蚤状溞D.pulex(GenBank:AJ245733.1)、美洲狗蜱Dermacentor variabilis(GenBank:EF488512.2)等的actin具有较高相似性(Indentity均为86%)。

图1 方形网纹溞的部分actin序列Fig.1 A part of actin sequence of C.quadrangular

2.2 RNAi载体的构建和dsRNA的诱导表达

根据所得actin序列设计引物扩增得到359bp的片段(见图1),将其连入L4440质粒得到dsRNA表达载体 Actin-L4440,并用于转化大肠杆菌 HT115。经IPTG诱导 5h后,提取 HT115菌体的总 RNA,RNA电泳图(图3)显示,泳道 1和 2为转入 L4440空载质粒的HT115的总RNA,其中泳道2为诱导后的L4440空载,它与泳道1在200bp处有差异条带(载体自身特性),由于它与细菌 RNA降解的部分发生重叠,而看不到差异条带,但空载诱导的序列与方形网纹溞没有同源关系,因此在实验中以此作为对照;泳道3表明 actin序列连入质粒,在不诱导情况下无特异的目的条带;泳道4表明actin序列连入质粒,需诱导才产生特异条带,大小约为500bp。证明泳道4代表的菌液诱导后的目的基因是正确的,数量上也满足实验要求。由此说明成功诱导出dsRNA。

由于细菌所诱导出来的dsRNA能长时间稳定存在(Liet al, 2011;王根洪等,2011;唐婷等,2012),因此可以用于后续实验。

2.3 RNAi的结果与鉴定

Real-time PCR基因定量结果显示,投喂表达actin dsRNA的HT115菌的方形网纹溞actin的相对表达量明显低于投喂空载L4440质粒的HT115菌的方形网纹溞。经 ANOVA检验,在检验水平P≤0.01时,两组间差异极显著。投喂12h后,实验组actin基因的表达量只是对照组表达量的15.3%,说明此方法能有效地敲降方形网纹溞actin基因的表达(图4)。

同时观察发现,随着培养时间增长,actin敲降组方形网纹溞死亡率明显高于对照组,尤其是 36h后,实验组死亡率平均值达到 71.67%,而此时对照组死亡率为37.78%。在48h,实验组死亡率达到97.22%,而此时对照组死亡率为54.44%(图5)。

3 讨论

RNAi现象广泛存在于线虫、昆虫、两栖类及哺乳动物中。在线虫中发现,RNAi信号能在细胞与细胞之间传播,引发多数组织细胞或全身性的RNAi效应,称为系统性基因沉默(systemic gene silencing)。大多数昆虫也存在RNAi信号的系统性传播现象,可以将dsRNA直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织,引发远距离靶基因的特异性沉默。基于此,开发出了直接注射或饲喂dsRNA的适用于卵、幼虫、蛹及成虫各发育阶段的昆虫RNAi技术(何正波等,2009)。但在枝角类动物中能否利用RNAi技术进行基因敲降尚无报道。

图2 方形网纹溞actin基因序列与其他物种actin的多序列比对以及序列的GenBank序列号Fig.2 Multiple alignment of actin sequences from C.quadrangular with those of other species Actin序列的GenBank登录号:Daphnia magna(AJ292554.1);Daphnia pulex(AJ245733.1);Dermacentor variabilis(EF488512.2);Drosophila melanogaster(K00674.1);Culex nigripalpus(EU301432.1);Rhipicephalus haemaphysaloides(HM140790.1)

本研究证实投喂表达actin dsRNA的大肠杆菌能有效干扰方形网纹溞体内基因的表达,证明枝角类动物同样存在RNAi信号的系统性传播现象。枝角类可作为水生动物基因功能研究的优良材料。如前所述,枝角类有形体较小、生长周期短、繁殖速度快,相对于许多如鱼、虾、贝类等中大型水生生物而言,不会存在繁育期时间长,养殖技术不完善的问题,而且进行枝角类 RNA干扰时往往以群体的形式进行研究,去除了大型生物只能进行个体研究的不足。另外枝角类可以以细菌为食,这样就使得采用投喂方式进行RNAi成为可能。本研究选用5龄的方形网纹溞(即2龄成体,1.0mm左右)作为实验材料,这是因为经过观察发现,方形网纹溞自幼溞 成长至 5龄的时间并不长,且此期的持续时间相对较长,这个时期直至之后的龄期其个体变化差别不大(庄德辉,1994),因此 5龄的方形网纹溞是十分适合进行RNAi实验的龄期。

通过细菌表达 dsRNA价格低廉,能表达出大量dsRNA,也易于操作。因此近年来,构建并使用dsRNA表达载体,达到RNAi效果的方法得到广泛应用(王根洪等,2011;唐婷等,2012)。本文在枝角类中进行的RNAi实验,能够为研究水生动物基因功能方法提供一定参考。1:未经IPTG诱导的L4440-HT115菌液的总RNA,2:经IPTG诱导的L4440-HT115菌液的总RNA,3:未经IPTG诱导的Actin-L4440-HT115菌液的总RNA,4:经IPTG诱导的Actin-L4440-HT115菌液的总RNA,箭头所示为差异条带(目的条带)

图3 dsRNA的诱导Fig.3 The induction of dsRNA

图4 定量PCR分析方形网纹溞actin表达水平Fig.4 The expression analysis of actin from C.quadrangular by real-time quantitative PCR

图5 投喂dsRNA后C.quadrangula的死亡率Fig.5 The mortality rate of C.quadrangular after fed dsRNA

本研究中,定量 PCR显示出明显的基因表达水平的敲降效果,通过往水体中加入经诱导的 Actin-L4440-HT115菌,使得actin受到干扰,引起群体死亡率上升,表明群体水平与分子水平的实验效果是一致的。由于actin是真核生物细胞骨架的组成蛋白之一,因此它的表达量下降可能会导致实验个体的死亡,本研究的结果也确实说明了RNAi增加了方形网纹溞的死亡率。

以上研究结果说明可以对方形网纹溞进行RNAi实验,且可以通过构建 RNAi干扰载体的方法去进行。对 actin基因的干扰后,在宏观上也能观察到实验组种群显著死亡。可以依此方法,利用RNAi技术对枝角类乃至与其他水生动物的基因进行研究,通过敲降基因,随即进行观察检测,对这些基因的功能有进一步的阐述,故而具有一定的意义。

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