大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病病原分离鉴定及致病性研究*

胡 娇 张 飞 徐晓津 苏永全 覃映雪 马 英张 艺 韩坤煌 鄢庆枇①

(1.集美大学水产学院 农业部东海海水健康养殖重点实验室 厦门 361021;2.厦门大学海洋与地球学院 厦门 361005;3.宁德市水产技术推广站 宁德 352101;4.宁德市富发水产有限公司 宁德 352103)

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是我国单一品种养殖量最大的海水鱼类,被农业部确定为我国六种最具优势出口水产品之一(陈强等,2007)。目前随着养殖规模的不断扩大,各种病害的发生也日趋频繁,新的病害种类也屡有发生。大黄鱼的内脏白点病是近几年网箱养殖大黄鱼的常见病害,2013年春季该病发生率和死亡率再创新高,给闽东地区大黄鱼养殖业带来严重的经济损失。

近年来的 1—4月为大黄鱼内脏白点病高发季节,海区水温超过20°C后该病就自然消退。病鱼体表无明显症状,解剖可见肝、脾、肾等内脏有0.5—3mm大小不等的白色结节,故称此病为内脏白点病。王国良等(2006)报道从患内脏白点病的大黄鱼鱼体内分离到鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)。沈锦玉等(2008)和邱杨玉等(2012)认为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是引起大黄鱼内脏出现白点的病原。本文首次采用生态模拟的方式从患病内脏白点病大黄鱼体内分离病原并进行其致病性研究,以期增进对养殖大黄鱼内脏白点病的认识并为疾病的防治提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

患内脏白点病大黄鱼取自宁德市富发公司大黄鱼养殖渔排,体重100g左右。

健康大黄鱼取自宁德市富发公司大湾渔排,体重150g左右。

1.2 病原菌的分离纯化

无菌操作从病鱼肝脏、脾和肾脏组织中取样,划线接种于TSA平板上,18°C培养24h。挑取优势菌落若干个和其它特征菌落进行划线分离三次,将纯化的菌落接种于TSA斜面18°C培养24h后用20%甘油生理盐水洗脱,–80°C低温冰箱保存备用。

1.3 回归感染实验

选择从脾脏分离的2株优势菌和4株非优势菌进行人工感染实验。实验共设6个实验组和1个对照组,每组各10尾大黄鱼,在1吨的养殖桶中暂养3d后开始实验。细菌18°C培养24h后用生理盐水制成菌悬液,实验组大黄鱼每尾背部肌肉注射0.2mL菌悬液,浓度为103cfu/g鱼体重,对照组大黄鱼每尾注射0.2mL无菌生理盐水。注射后继续饲养 7d,每天观察 3次,记录各组的死亡情况。死鱼及时捞起,解剖观察内脏是否有白色结节。整个感染过程的水温为16—19°C。

选择从脾脏分离的 1株优势菌,实验共设 3个实验组和3个对照组,感染过程的水温为7—10°C、16—19°C 和 24—27°C,对照组大黄鱼每尾注射0.2mL无菌生理盐水,其它实验条件同上。

选择从脾脏分离的1株优势菌,实验共设6个实验组和1个对照组,感染浓度10、102、103、104、105和106cfu/g鱼体重,对照组大黄鱼每尾注射0.2mL无菌生理盐水,整个感染过程的水温为 16—19°C,其它实验条件同上。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 飞行时间质谱微生物鉴定仪分析 挑取适量菌落样品,加入无水乙醇固定灭活 3min,10000r/min高速离心去上清。先后加入70%甲酸和乙腈,仔细混匀室温放置3min,10000r/min高速离心,吸取上清点靶,使用Microflex LRF20飞行时间质谱微生物鉴定仪进行鉴定。

1.4.2 病原菌16S rDNA基因的测定 使用 E.Z.N.A BacterialDNA Kit(购自Omega公司)提取菌株NZBD9和NZBD11基因组DNA。设计2条引物(由上海英俊生物技术有限公司合成),27F:5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’,1492R:5’-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3’。25μL PCR 扩增体系:模板 1μL,引物各 0.5μL,Mg2+2μL,DNTP 2μL,10×Buffer 2.5μL,Taq酶0.2μL,去离子水15.3μL。扩增条件:预变性94°C、5min;变性 94°C、50s;退火 54°C、50s;延伸72°C、90s;然后回到变性温度 30个循环;保温 72°C、10min。1%琼脂糖凝胶100mA,110V,电泳20min判定 PCR扩增结果。PCR产物回收纯化:用 E.Z.N.A GelExtraction Kit(购自Omega公司)回收纯化PCR产物。纯化后的PCR产物送华大基因进行基因测序。

1.5 系统发育树构建

病原菌的16S rDNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast/)进行序列同源性分析,并使用 ClustalX 1.83软件与从GenBank数据库中获得的序列相似性较高的菌株的序列进行多序列匹配排列,采用邻接法获得系统发育树,并通过 Bootstrap法(1000次重复)检验。

1.6 药物敏感实验

采用纸片扩散法。致病菌于 TSA斜面 18°C培养24h后用无菌生理盐水洗脱制成浓度约为10×108cfu/mL菌悬液,取 0.1mL菌悬液分别涂布于TSA平板,10min后贴上不同的药物纸片(购自杭州天和微生物试剂公司),于 18°C培养 24h 后测量抑菌圈直径。

1.7 病理组织切片的制作及观察

分别取对照组和有典型病症大黄鱼的头肾和肝组织,用 Bouin氏液固定,石蜡包埋。通过 Leica RM2128型切片机横、纵向连续切片(厚3—5μm),于Leica AUTOSTAINER XL染色机中进行H.E染色,中性树胶封片。Leica DM 4500B自动数码显微摄影系统观察、摄影。

2 结果与分析

2.1 菌株分离结果

通过平板划线分离纯化共得到 16株候选菌,编号依次为NZBD1—NZBD16,其中优势菌有NZBD1、NZBD9、NZBD11、NZBD14和 NZBD15。18°C培养48h后,菌株NZBD9和NZBD11在TSA琼脂平板上形成为直径1—2mm、白色、表面光滑湿润、边缘光滑的圆形菌落。

2.2 人工感染

养殖水体16—19°C条件下回归感染实验结果如表1所示。6个实验组,只有NZBD9和NZBD11感染组的实验鱼出现死亡,NZBD9和 NZBD11是优势菌株,且致病性强,所以 NZBD9和 NZBD11为导致养殖鱼死亡的致病菌。

表1 6株分离菌人工感染结果Tab.1 The results of artificial infection of 6 isolations

对菌株NZBD9的进一步人工感染实验结果如表2所示。在10 cfu/g的浓度下,实验鱼无死亡;在102cfu/g的浓度下,开始出现死亡;1×105cfu/g的浓度下实验鱼的死亡率为 100%;对照组的实验鱼无死亡。

对菌株NZBD9在3个温度下的进一步人工感染实验结果如表3所示。在7—10°C和24—27°C水体条件下,实验鱼无死亡;在16—19°C水体条件下,死亡率达50%;对照组的实验鱼无死亡。

表2 菌株NZBD9人工感染结果Tab.2 The results of artificial infection of strain NZBD9

表3 不同温度下菌株NZBD9人工感染结果Tab.3 The results of artificial infection of strain NZBD9 under different temperatures

如图1所示,感染致病菌的大黄鱼肾脏、脾脏出现直径 0.4—1.0mm的白点,严重的病鱼肝也会出现白点。从实验死亡鱼分离得到与菌株 NZBD9和NZBD11相同的菌落。

图1 大黄鱼内脏白点病病征Fig.1 Symptoms of internal organs white-spots disease of P.crocea

2.3 16S rDNA基因检测结果

菌株NZBD9和NZBD11的16S rDNA基因检测结果如图2。2个菌株的16S rDNA基因的长度同为1459bp,而且序列相同,可鉴定为同一菌株。

2.4 时间飞行质谱微生物鉴定仪分析结果

菌株NZBD9和NZBD11在高通量微生物鉴定仪下分析结果如图3、图4、图5。实验结果表明,菌株NZBD9和NZBD11同为变形假单胞菌。

2.5 系统发育树构建

Blast结果发现 2株致病菌与变形假单胞菌 16S rDNA的同源性达到 100%,从构建的系统发育树中可见 NZBD9菌株与变形假单胞菌聚为一支,说明NZBD9菌株与变形假单胞菌亲缘关系最近,可将其鉴定为变形假单胞菌。系统发育树如图6所示。

2.6 药敏实验结果

菌株NZBD9对19种抗生素纸片的敏感性测试结果见表4。结果显示,9菌株对庆大霉素、诺氟沙星、多粘霉素B、依诺沙星、四环素、卡那霉素、链霉素、强力霉素、新霉素、新生霉素和氧氟沙星 11种药物敏感;对青霉素、复合磺胺、万古霉素、利福平、红霉素、呋喃唑酮、氯霉素和呋喃妥因 8种药物有抗性。

图2 菌株NZBD9和NZBD11的16S rDNA基因序列Fig.2 Sequence of 16S rDNA genes of strain NZBD9 and NZBD11

图3 时间飞行质谱鉴定仪对NZBD9和NZBD11的鉴定结果Fig.3 Results of strain NZBD9 and NZBD11 identified by Time of Flight Mass Spectrometer

2.7 石蜡组织切片观察

2.7.1 肾脏 健康大黄鱼的肾脏各细胞结构完整,质地均匀,肾小管由单层上皮细胞构成,上皮细胞排列紧凑,上皮细胞间界限清晰(图7a)。感染变形假单胞菌后,肾小管形状较不规则,肾小管上皮细胞肿胀,排列较紊乱(图7c),管腔变窄或闭塞;较严重区域肾小管完全失去原来的组织结构,解体后形成大面积的坏死灶,坏死灶中心区充满解体后的细胞碎片(图7b)。

图4 时间飞行质谱鉴定仪对NZBD9的具体鉴定结果Fig.4 Results in detail of strain NZBD9 identified by Time of Flight Mass Spectrometer

图5 时间飞行质谱鉴定仪对菌株NZBD11的具体鉴定结果Fig.5 Results in detail of strain NZBD11 identified by Time of Flight Mass Spectrometer

图6 NZBD9菌株16S rDNA序列的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain NZBD9

2.7.2 脾组织 健康大黄鱼的脾脏由结缔组织网、毛细血管网和间于其中的细胞群组成。细胞的组成有红血球形成细胞、未成熟红血球、成熟红血球、淋巴球、单核球、吞噬细胞等,这些细胞密集相间,其中淋巴细胞可聚集形成淋巴岛(图7d)。大黄鱼受变形假单胞菌感染后,脾脏组织恶化、充血,坏死较严重(图7e);脾组织吞噬一定量菌体后,髓窦内堆积大量含铁血黄素,髓窦周围出现许多空泡(图7f)。

2.7.3 肝组织 健康大黄鱼肝组织结构清晰,细胞形状比较规则,是略带圆形的多角形细胞,排列较均匀规则,具有球形并带有一个核仁的细胞核,细胞核圆形,位于细胞的中间;细胞质中含有丰富的脂肪和糖原,在石蜡切片中,通过 H.E染色后,常常呈现许多空泡样结构(图7g)。患病鱼部分肝细胞坏死严重,细胞萎缩,排列疏松,肝细胞界限模糊不清,空隙较明显(图7h);许多肝细胞实质结构遭到破坏,干细胞崩解,呈现空泡化(图7h和图7i)。

图7 患病大黄鱼肾脏、脾脏、肝脏组织病变Fig.7 Pathological changes of kidney,spleen and liver tissues of diseased P.crocea

表4 菌株NZBD9的药敏性实验结果Tab.4 Results of antibiotic sensitivity test of strain NZBD9

3 讨论

内脏白点病是养殖大黄鱼的常见病,多发生在水温较低的春节。内脏白点病已危害养殖大黄鱼多年,且危害逐年严重。近年来,许多学者对大黄鱼内脏白点病的病原进行了研究,但目前尚未有统一的定论。王国良等(2006)认为大黄鱼内脏白点病的病原是诺卡氏菌(Wanget al,2005),刘家富等(2004)认为大黄鱼内脏白点病的病原是门多萨假单胞菌和铜绿假单胞菌,而刘振勇等(2002)认为大黄鱼内脏白点病的病原仅有门多萨假单胞菌。沈锦玉等(2008)和邱杨玉等(2012)认为大黄鱼内脏白点病的病原是恶臭假单胞菌,Blanco 等(2002)、López-Romalde 等(2003)和 Balboa等(2007)认为大黄鱼内脏白点病的病原是荧光假单胞菌。本文从患内脏白点病大黄鱼的内脏分离到多株细菌,在进行人工感染的6个分离株中只有2株对大黄鱼有致病性,其它4株都不致病,而且致病的2株分离株同为变形假单胞菌,这说明宁德大黄鱼内脏白点病的病原菌为变形假单胞菌。本文从病原分离至人工感染全程模拟自然发病的水温,分离得到有很强致病性的变形假单胞菌。该菌不仅发病的症状与自然发病的内脏白点病一致,发病的水温要求也与自然发病的水温一致,这进一步证实变形假单胞菌为宁德养殖大黄鱼内脏白点病的病原菌。

变形假单胞菌是自然环境中的常见菌,对多种污染物有较强的分解能力,常被用于污水处理(陈亚丽等,2002;曹军伟等,2011)。水产养殖较为常见的致病菌。变形假单胞菌引起水产养殖疾病也有所报道。这种细菌曾在带有细菌性出血性腹水的养殖香鱼上分离得到(Nishimoriet al,2000)。由变形假单胞菌引起的香鱼细菌性出血性腹水病经常在引入自然或人工产的鱼苗到养殖池中后短时间内暴发,并且在养殖时期的任何阶段都可能暴发(Seet al,2000)。病原菌变形假单胞菌是一种条件致病菌,但是肌肉注射感染实验表明其对香鱼有极高的毒力,半致死剂量(LD50)为101.2cfu/fish。变形假单胞菌能够在饲养香鱼的淡水水体中生长和繁殖(Seet al,2000),变形假单胞菌通过扩散在香鱼养殖水体中,从而迅速水平传播这种疾病。

本文所分离的变形假单胞菌在 28°C生长良好,而大黄鱼内脏白点病仅见于水温 20°C以下,本文人工感染的结果也显示变形假单胞菌在23—27°C水温对大黄鱼不致病,其原因可能是由于变形假单胞菌分泌的胞外产物在不同温度下有所不同,也可能是由于大黄鱼在低温下抗感染免疫力低下,给变形假单胞菌以可趁之机。本文的研究结果显示:此次从患病大黄鱼上分离的变形假单胞菌对青霉素、复合磺胺、万古霉素、利福平、红霉素、呋喃唑酮、氯霉素和呋喃妥因等8种抗生素已经产生一定的抗药性,因此对于大黄鱼内脏白点病的防治应该主要考虑提高大黄鱼的抗病免疫力。

王国良,袁思平,金 珊,2006.网箱养殖大黄鱼诺卡氏菌病的初步研究.水产学报,30(1):103—107

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