环氧化酶-2/前列腺素E2信号传导通路对骨折愈合的影响及相关药物研究进展*

陈秉雄,宋敏,陈秉虎,董万涛

(1.甘肃中医学院,兰州 730000；2.甘肃省定西市临洮县人民医院,定西 730500；3.甘肃中医学院附属医院,兰州 730020)

·药学进展·

环氧化酶-2/前列腺素E2信号传导通路对骨折愈合的影响及相关药物研究进展*

陈秉雄1,2,宋敏1,陈秉虎2,董万涛3

(1.甘肃中医学院,兰州 730000；2.甘肃省定西市临洮县人民医院,定西 730500；3.甘肃中医学院附属医院,兰州 730020)

探讨环氧化酶-2/前列腺素E2(Cox-2/PGE2)信号传导通路及其PGE2生物学意义,阐述Cox-2/PGE2信号传导通路及其产物作用于EP2/EP4受体,促进PGE2、血管内皮生长因子(VEGF)等因子的分泌,参与骨折端内皮细胞、血管及骨细胞的形成,完成骨折的修复与重建体系。概述Cox-2/PGE2信号传导通路抑制药干扰骨折的愈合的机制与抑制药的合理应用。从而开拓Cox-2/PGE2信号传导通路影响空泡型氢离子ATP酶、OGP-RANKL-RANKN系统等信号途径的研究将有可能成为介导骨折愈合的新靶标。

环氧化酶;前列腺素;骨折愈合;信号通路

创伤性骨折是一种常见骨外伤综合征,造成骨折处骨骼和骨髓破坏、局部肌肉血管和神经损伤,其愈合过程复杂,不但有神经系统的参与,而且体液调节在其修复体系中发挥着重要作用。环氧化酶(cyclooxygenase,Cox)又称前列腺素合成酶(prostaglandin synthetase,PGHS),是前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)合成过程中一个重要的限速酶。当机体受到各种刺激因素包括生长因子、细胞因子、炎性递质等作用时,Cox-2的表达迅速上调,PGE2是Cox-2催化花生四烯酸生成的主要产物[1]。Cox-2/ PGE2信号转导通路在骨折愈合过程及骨代谢过程中发挥重要作用。

1 Cox-2/PGE2的信号传导途径及生物学意义

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)大量存在于细胞膜磷脂成分内,当细胞受到刺激时细胞的磷脂酶激活,分别生成前列腺素(prostaglandin,PG)和白三烯(leukotriene,LT)[2]。其中PGE2的产生主要有3步:①细胞膜上的磷酸经过磷脂酶A2水解,生成AA；②AA经过Cox-2或Cox-1催化生成前列腺素H2(PGH2)；③PGHS的作用下PGH2转化为PGE2。

Cox-2/PGE2生物学作用是通过G耦联蛋白膜受体EP产生作用,EP受体包括EP1、EP2、EP3、EP4。PGE2产生后可通过自分泌或旁分泌途径与细胞膜上的G蛋白受体家族即EP2、EP4受体结合,从而导致第二信使环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平升高,而激活的EP1使细胞溶质的游离钙水平升高,细胞内升高的cAMP将更多地刺激Cox-2和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的高表达,PGE2可通过正反馈信号通路促使Cox-2高表达[3-4]。其中EP2/EP4与骨折愈合的关系密切,这些信号转导促使VEGF在骨折端浓度的升高,促进血管生长、内皮细胞的增殖[5]。PGE2产生后通过G蛋白耦联途径促进细胞增殖,也可通过核内过氧化物酶增殖体激活受体直接促进细胞的生成。Cox-2及其主要产物PGE2刺激骨细胞的增殖,并使骨髓间充质干细胞可以正常启动分化发育为成骨前体细胞,成骨前体细胞在调节蛋白的作用下,进一步增殖分化为成熟的成骨细胞,成骨细胞分泌骨基质形成骨痂,骨痂经过后期的自身改建完成骨折的修复[6]。研究表明,Cox-2/PGE2信号转导通路抑制药能抑制PGE2的合成,从而抑制多种细胞因子的合成,如VEGF等因子的合成有抑制作用,从而抑制其血管内皮细胞、骨细胞的形成。虽然能缓解骨折、软组织损伤产生的疼痛,但同时会延迟骨折的愈合。

2 Cox-2/PGE2对骨折愈合影响的病理生理机制

2.1 PGE2对血管内皮细胞的影响 参与骨折愈合的因素很多,其中VEGF作为血管生成的最重要因子,在骨折愈合中血管内皮细胞的生成扮演举足轻重的角色。创伤后血管的再生可由多种生长因子诱导,能特异作用于血管内皮细胞表面的受体,促进其增殖和血管生成。新生血管的生成,为骨折的愈合提供营养物质并排泄代谢产物,提供骨再生必需的微环境。Cox-2/PGE2信号转导通路可以上调β-catenin蛋白表达,从而激活Wnt/β-catenin信号上调VEGF[7]；Cox-2/PGE2对VEGF的调节作用与EP2受体激动、cAMP-PKA信号转导通路激活有关[8]；田建等[9]研究发现,Cox-2与VEGF表达及其蛋白产物呈正直线关系。Cox-2/PGE2信号通路可通过VEGF特异性作用于血管内皮细胞,促进内皮细胞分裂、增殖,并诱导产生蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子来促进血管形成。VEGF是一种具有肝素结合活性的生长因子,能特异性地作用于血管内皮细胞,促使体内血管形成[10]。VEGF通过活化磷脂酶C和刺激第2信使IP3直接促进骨折端及周围软组织血管内皮细胞增殖,增加微血管通透性,形成血管生成的临时基质。实验表明PGE2引起血管扩张和血管生成,但它却不直接作用于内皮细胞刺激内皮细胞增殖[11]。VEGF同时也能促进内皮细胞的迁移、增殖。骨折修复,特别是纤维骨痂、软骨痂形成到成熟骨痂生成阶段的血管形成,加速软骨的钙化及骨组织的改建过程。所以Cox-2/PGE2信号通路对于VEGF的调节促进血管的形成以及骨的生成耦联的主要机制。在骨折的修复过程中,VEGF参与纤维骨痂的转化,软骨骨痂、骨性骨痂及其成熟骨痂的各个时期,并参与在血管的形成、软骨的吸收与骨痂的改建的过程中[12]；成骨细胞表面上的flt-1与VEGF特异性的结合,聚集成骨细胞在骨折部位,在VEGF所提供的微环境下,促进骨细胞的分化,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性增强,其ALP的高表达是NF-κB途径来介导,抑制Id2细胞因子,诱导成骨细胞的分化[13]。徐晓峰等[14]在实验中发现损伤周围比损伤中心VEGF mRNA、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表达时间提前和延长,其强度也低于损伤外周区,血管的修复先于骨的修复,其作为骨折愈合修复的重要调节因子发挥作用。骨痂形成后,还需要对形成的骨痂进行塑形、改建,破骨细胞吸收多余的成分,继而成骨细胞形成新骨。在骨小梁的表面的成骨细胞释放VEGF,形成毛细血管,破骨细胞移行在毛细血管的尖端,缩短吸收的距离,而成骨细胞产生细胞外基质[15]。VEGF在骨折愈合修复过程中不但能促进血管的形成,而且能直接或间接的影响骨细胞等组织的增殖与分化,其在多种细胞因子的作用下完成骨折愈合与修复,对于骨折的愈合有极为重要的作用。

2.2 Cox-2/PGE2对骨细胞的影响 在骨折愈合中, Cox-2/PGE2传导通路激活,PGE2高表达,通过MAPK信号途径,促使骨髓细胞c-fox、c-jun和egr-1基因表达,加强骨间质细胞向成骨细胞的转化加快新骨生成[16]；Cox-2/PGE2能刺激大鼠骨表面成骨细胞增殖、分化和分泌并能激活骨髓来源的间充质细胞,使其转化前成骨细胞[17]；Cox-2表达明显上调,导致PGE2合成增加,PGE2可以刺激成骨细胞的增殖,并促使成骨细胞分泌更多的骨生长因子,这些生长因子有利于骨基质及骨细胞的形成和钙盐沉积[18]；PGE2能增加骨内钙化组织含量、骨基质的形成、骨愈合速度以及成骨细胞的复制和定向分化功能[19]；Cox-2催化合成的PGE2介导成骨细胞内的cAMP发挥成骨效应,加速成骨细胞增殖分化成熟,促进骨痂的钙化和重塑,以及提前形成软骨内成骨和编织骨痂,是骨折愈合提前[20-21]。成骨细胞内的Ⅰ型胶原纤维、骨钙素(bone glaprotein,BGP)等都是与软骨内骨化相关的重要细胞外基质蛋白,它们的合成受到PGE2和cAMP调控[22]。骨折发生后,机体通过各种信号通路激活,产生PGE2、VEGF等修复因子,积极动员骨折断端周围骨膜、骨髓和骨组织内的骨原细胞、成骨细胞等参入骨组织的修复及重塑。局部注射PGE刺激骨的生成,并且Cox-2抑制药减少PG的合成,进而减少骨的形成。Cox-2是通过调节蛋白聚糖类(proteoglycans,PG)对骨发挥作用,其中PG对骨的新陈代谢具有双向调节作用,尤以PGE2作用最强,低剂量的PGE2刺激成骨细胞增殖、促进骨形成,高剂量的PGE2能够提高成骨细胞内cAMP的水平,使其向破骨细胞转化,刺激骨吸收[23]。

3 信号转导通路抑制药对于骨折愈合的影响

信号转导通路抑制药能选择性地抑制Cox-2/ PGE2信号传导通路。从而使AA转化为PG过程受到抑制,减少PGE2的生成,延迟骨折的愈合。临床上,如非甾体抗炎药物(nonsteroidal antiinflarmmatory drugs, NSAIDs)能减少炎性反应达到抗炎镇痛的作用,但是同样会干扰骨折的愈合[24]。

3.1 NSAIDs影响骨折愈合的生理病理机制 成骨细胞和破骨细胞在骨折的局部募集、活化及耦联,完成骨折的修复。NSAIDs能降低PGE2的合成,干预成骨细胞和破骨细胞的正常修复功能。在体外实验中发现NSAIDs能抑制干细胞向成骨细胞的分化,而脂肪细胞相应的增加；并且能显著抑制破骨细胞的分化、成熟以及破骨细胞的活性[25]。体内实验证实在大鼠股骨远端钻孔造成骨缺损,10 d后发现持续应用NSAIDs组的缺损区成骨细胞数量显著下降[26]。通过上述实验,推测Cox-2/PGE2-成骨细胞和破骨细胞之间的信号途径是影响骨折愈合的分子机制之一。

NSAIDs对骨折端血供的影响和对骨折的不良影响是相互独立的,证实NSAIDs影响了骨折端血管再生,进而影响骨折端血液供应及细胞增殖,以及骨痂的形成。对于骨折的愈合极为不利。对大鼠的骨折模型中,用多普勒检测骨折端的血液供应,NSAIDs组骨折端的血液供应低于对照组。其在放射学分析、组织学评价以及生物力学的研究中发现NSAIDs组的骨折愈合时间低于对照组[27]。

细胞因子在调控骨折愈合过程中发挥着重要的作用,数量众多,如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、白细胞介素-1 (interleukin-1,IL-1)等。对大鼠骨折愈合过程中血清TGF-β浓度的影响进行研究时发现:骨折后各组进行用药干预,第1天各组的血清TGF-β浓度差异无统计学意义；而第1,2,4周萘普生钠组的血清TGF-β浓度显著低于对照组,粒细胞集落刺激因子组的血清TGF-β浓度则显著高于对照组[28]。血清TGF-β浓度在正常骨折愈合过程中会明显升高,起到启动骨折愈合过程、促进骨折愈合的作用。NSAIDs能抑制TGF-β的形成和释放,从而干扰骨折的愈合。

3.2 NSAIDs延缓骨折愈合的时间、降低骨折愈合的强度 NSAIDs对骨折愈合的不利影响首先表现为骨折愈合时间延长。研究表明核因子-κB抑制药BAY11-7082能够抑制PGE2诱导的ALP活性、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)以及Id2的表达,核因子-κB抑制药能够抑制骨折部位的PGE2生物合成、ALP的活性以及BMP-7和Id2表达,引发骨折愈合的延迟[13]。XIE等[29]通过大鼠骨折模型研究骨的重建和塑型,NSAIDs并不会明显干扰编织骨重塑的机制,但会延长骨折愈合的时间。Cox-2抑制药影响了骨折局部骨膜前体细胞的活化、增殖、分化,从而影响到骨折愈合早期的骨纤维愈合,Cox-2抑制药对于骨折的延迟愈合可能具有剂量依赖性,但其确实干扰了骨折的愈合[30]。选择性Cox-2抑制药均有可能抑制延缓骨折的愈合,其原因都是抑制Cox-2的生成,影响PGE2的合成。在动物模型上使用PGE2能增加骨折愈合的概率,局部使用PGE2也能刺激骨的生成。MURNAGHAN等[27]认为NSAIDs延迟骨折愈合,可能抑制骨折部位血管再生。NSAIDs在延缓骨折愈合的同时,降低了骨折愈合的强度,使软骨内软骨数量增多,成熟骨组织减少,进一步会引起骨折不愈合率明显增加。BERGENSTOCK等[31]在实验中发现塞来昔布组明显降低已愈合股骨的最大切变应力和最大切变模量,并且塞来昔布组中软骨细胞数量明显高于对照组,导致骨的强度下降。在大部分动物实验研究中, NSAIDs延迟骨折的愈合,降低骨折愈合的强度,增加骨的不愈合率。

3.3 NSAIDs在骨折愈合过程中的合理应用NSAIDs对骨折的愈合有不利的影响,但是仍然存在不同的认识。NSAIDs对于骨折的愈合是否具有时间和剂量依赖性。目前还没有令人信服的结论。NSAIDs主要影响骨折愈合的早期,与剂量呈正相关,特异性的抑制药对骨折愈合的影响大于非特异性的抑制药,所以在药物的选择上应多选择非特异性药物,而且在发生某些并发症时应及时停药[32]。但是常规适量应用NSAIDs对异位化骨有一定的预防作用。

4 展望

骨折愈合是多种细胞因子参与、多个信号传导途径介导的生理生化过程。损伤与修复共存,促进与抑制平衡,形成与吸收并存。Cox-2/PGE2信号传导通路干预骨折愈合分子机制尚不明确。Cox-2/PGE2表达水平的升高,通过对NF-κB、Wnt/β信号途径等多个途径的调控,影响空泡型氢离子ATP酶、骨保护素-核因子-κB受体活化因子配体-核因子-κB受体活化因子系统等多个信号途径对骨折愈合分子机制,NSAIDs对于骨折愈合的影响仍然存在异议,因此合理应用NSAIDs又成为一个热点课题,有待于进一步的研究,这些方面的研究将会给骨科的基础研究、临床治疗提供新的思路。

[1] 张陈彦,郭影.环氧化酶-2在骨代谢中的研究进展[J].中国老年学杂志,2010,5(30):719-721.

[2] 李玉林.病理学[M].北京:人民卫生出版社,2013:67.

[3] SENO H,OSHIMA M,ISHIKAWA T O,et al.Cyclooxy genase 2-and prostaglandinE(2)receptor EP(2)-dependentangiogenesisinApc(Delta716)mouse intestinal polyps[J].Cancer Res,2002,62(2):506-511.

[4] SONOSHITA M,TAKAKU K,SASAKI N,et al.Acceleration of intestinal polyposis through prostaglandin receptor EP2 in Apc(Delta 716)knockout mice[J].Nat Med,2001,7(9):1048-1051.

[5] 朱森,杨吉春,管又飞.前列腺素E2受体亚型EP2和EP4的最新研究进展[J].临床医学工程,2009,16(7):109-112.

[6] PAPE H C,MAECUCIO R,HUMPHREY C,et al.Traumation and fracture healing[J].Orthop Trauma,2010,24(9): 522-525.

[7] 刘宣,李丹光,周利红,等.Cox-2/PGE2激活Wnt/βcatenin信号通路调控人肠癌细胞VEGF表达[J].第二军医大学学报,2012,33(11):1178-1181.

[8] XIE C,LIANG B J,XUE M,et al.Rescue of impaired fracturehealinginCox-2-/-miceviaactivationof prostaglandin E2receptor subtype 4[J].Am J Path,2009, 175(2):772-785.

[9] 田建,范存义,芮永军,等.环氧化酶-2、骨形态形成蛋白2和血管内皮生长因子在异位骨化组织中的表达[J].中国组织工程研究,2012,16(42):7814-7818.

[10] CARMEIIT P,COLLEN D.Moiecuiar analysis of blood vessei formation and disease[J].Am J Physiot,1997,273(8): 2091-2104.

[11] SPISNI E,MANICA F,TOMASI V.Involvement of prostanoids in the regulation of angiogenesis by polypeptide growth factors[J].Prost Leukot Essent Fatty Acids,1992, 47(1):111-115.

[12] 孙华,宋开茂,王敏,等.VEGF对兔骨髓细胞分化形成破骨细胞的诱导作用[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2011,21(1):11-13.

[13] 邱小忠,王国栋,胡晓芳,等.PGE2和NF-κB信号途径在骨再生中的相互作用[J].中国临床解剖学杂志,2012, 30(3):315-319.

[14] 徐晓峰,李阳,钱栋,等.骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子mRNA在股骨骨不连大鼠损伤区域的动态表达[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,37(14): 6857-6860.

[15] STREETEN E A,BRANDI M L.Biology of bone endothelial cells[J].Bone Miner,1990,10(1):85-94.

[16] MINAMIZAKI T,YOSHIKO Y,KOZAI K,et al.EP2and EP4receptorsdifferentiallymediateMAPKpathways underiling anabolic actions of prostagland E2on bone formation in rat calvaria cell cultures[J].Bone,2009,44 (6):1177-1185.

[17] PATRICK R F,ANGELA M C.Nothing but skin and bone [J].J Clin Invest,2006,116(5):1140-1149.

[18] 杨周岐,孟芮,王哲,等.PGE2抑制肿瘤坏死因子诱导的成骨细胞凋亡[J].中国细胞生物学学报,2011,33(1): 27-34.

[19] NORRDIN R W,SHIH M S.Systemic effects of prostaglandin E2on vertebral trabecular remodeling in beagles used in a healing study[J].Calcif Tissue Int,1988,42 (6):363-368.

[20] TANAKA M,SAKAI A,UCHIDA S,et al.Prostaglandin E2receptor(EP4)selectiveagonist(ONO-4819.CD) accelerates bone repair of femoral cortex after drill-hole injury associated with local up-regulation of bone turnover in mature rats[J].Bone,2004,34(6):940-948.

[21] SAKUMA Y,LI Z,PILBEAM C C,et al.Stimulation of cAMP production and cyclooxygenase-2 by prostaglandin E (2)and selective prostagl and in receptor agonists in murine osteoblastic cells[J].Bone,2004,34(5):827-834.

[22] WEINREB M,GROSSKOPF A,SHIR N.The anabolic effect of PGE2in rat bone marrow cultures is mediated via the EP4receptor subtype[J].Am J Physiol,1999,276(2 Pt 1):376-383.

[23] KIM M,JUN H K,CHOI B K,et al.Td92,an outer membraneproteinofTreponemadenticola,induce osteoclastogenesisviaprostaglandinE(2)-Mediated RANKL/osteoprotegerin regulation[J].J Periodontal Res, 2010,45(6):772-779.

[24] GREGORY L S,FORWOOD M R.Cyclooxygenase-2 inhibition delays the attainment of peak woven bone formation following four-point bending in the rat[J].Caleif Tiss Int, 2007,80(3):176-183.

[25] KELLINSALMI M,PARIKKA V,RISTELI J,et al.Inhibition of cyclooxygenase-2 down-regulates osteoclast and osteoblast differentiation and favours adipocyte formationin vitro[J].Eur J Phamacol,2007,572(23):102-110.

[26] KRISCHAK G D,AUGAT P,BLAKYTNY R,et al.The non-steroidal anti-inflammatory drug diclofenac reduces appearance of osteoblasts in bone defect healing in rats [J].Arch Orthop Trauma Surg,2007,127(6):453-458.

[27] MURNAGHAN M,LI G,MARSH D R.Nonsteroidal antiinflammatory drug-induced fracture nonunion:an inhibition of angiogenesis[J].J Bone Joilt Surg Am,2006,88(Suppl 3):140-147.

[28] KAYGUSUZ M A,TURAN C C,AYDIN N E,et al.The effects of G-CSF and naproxen sodium on the serum TGF-beta 1 level and fracture healing in rat tibias[J].Life Sci, 2006,80(1):67-73.

[29] XIE C,MING X,WANG Q,et al.Cox-2 from the injury milieu is critical for the initiation of periosteal progenitor cell mediated bone healing[J].Bone,2008,43(6):1075-1083.

[30] 刘恒,曹永平,杨昕.选择性环氧化酶-2抑制药对骨折愈合过程的影响[J].实用骨科杂志,2010,16(9):664-666.

[31] BERGENSTOCK M,MIN W,SINON A M,et al.A comparison between the effects of acetam inophen and celecoxib on bone fracture healing in rats[J].Orthop Trauma,2005, 19(10):717-723.

[32] 张超,董英海.非甾体类消炎药对骨折愈合影响的研究进展[J].临床骨科杂志,2009,12(2):226-229.

DOI 10.3870/yydb.2014.09.023

R982;R683

A

1004-0781(2014)09-1197-05

2013-09-20

2013-11-07

*吴阶平医学基金会临床科研专项基金资助项目(320.6750.11061)；甘肃省青年科技基金计划(1208RJYA066)；甘肃省自然科学基金资助项目(1010RJZA160)

陈秉雄(1983-),男,甘肃临洮人,在读硕士,研究方向:中医药治疗骨伤疾病的研究。电话:(0)13919484035；E-mail:cxx19830802@163.com。

董万涛(1980-),男,甘肃临洮人,主治医师,硕士,研究方向:骨延迟愈合与不愈合的中医药防治。电话:(0) 13893262503,E-mail:dwt130@126.com。