骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的鉴定指标

马新喆，张娟娟，吕 洋(综述)，王海萍(审校)

(河北北方学院组织学与胚胎学教研室，河北 张家口 075000)

近些年来，心血管疾病越来越引起人们的重视，随着生活节奏的加快，死于心血管疾病的人数日益增加，心肌梗死、心力衰竭等成为常见病。心肌细胞是终末分化细胞[1-2]。现有的医疗水平和治疗方法无法从根本上修复坏死的心肌细胞，如何改善心肌功能，提高心肌效率，从细胞水平上预防和治疗疾病，成为一项重要的课题。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向心肌分化的潜能，使得BMSCs成为细胞移植治疗心肌损伤最有前途的细胞来源之一[3-4]。诱导BMSCs分化为心肌细胞成为国内外该领域的研究热点。目前已发现多种诱导剂能作用于BMSCs使其分化为心肌样细胞[5-6]。本文对研究BMSCs诱导分化为心肌样细胞的检测指标进行综述。

1 结蛋白与α肌动蛋白

结蛋白与α肌动蛋白作为心肌细胞分化的早期标志已经得到了公认，是目前用来特异性检测心肌细胞应用次数最多也是最普遍的指标。结蛋白是最早表达于未分化的肌母细胞中的肌源性蛋白，在肌源性细胞发育、成熟的过程中起重要作用，能够维持肌纤维形态，连接细胞核与细胞膜，从而使肌小节之间发生信号联系。α肌动蛋白是肌动蛋白的一种亚型，是骨骼肌和心肌中具有特异性收缩功能的细胞骨架蛋白，为胎儿或新生儿心室肌的主要成分。指导α肌动蛋白组织特异性表达的是α肌动蛋白启动子。α肌动蛋白启动子是心肌细胞高表达的强启动子，在心肌细胞或心肌组织中高效表达，在其启动子区域有转录因子的特定结合序列，表达受转录因子的调控。Klug等[7]采用人类α肌动蛋白启动子来筛选纯化人类胚胎干细胞分化的心肌细胞，得到了99%纯的心肌细胞。

结蛋白和α肌动蛋白的表达阳性说明BMSCs发生了肌源性分化。华声瑜等[8]通过研究丹酚酸B对大鼠BMSCs分化过程中结蛋白、α肌动蛋白信使RNA表达的影响的结果显示，5-氮胞苷组和5-氮胞苷+丹酚酸B组各样本中均出现明确的心肌早期分化基因；与5-氮胞苷组相比，5-氮胞苷+丹酚酸B组的结蛋白和α肌动蛋白信使RNA的表达显著增加，中药单体丹酚酸B对BMSCs向心肌细胞的分化具有一定的诱导或促进作用。

2 肌钙蛋白

肌钙蛋白是一种调节蛋白，分子呈球形，包括三个亚单位：肌钙蛋白I是抑制亚单位，可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，阻止肌肉收缩；肌钙蛋白C是钙离子受体，与Ca2+结合，活化细肌丝，相对分子质量为18×103；肌钙蛋白T能将肌钙蛋白附着在原肌球蛋白上，使原肌球蛋白与肌钙蛋白结合成原肌球蛋白-肌钙蛋白复合物，并附着在肌动蛋白双股螺旋状的纵沟内[9]。肌肉的调节由Ca2+介导，影响到肌动蛋白、甲胎蛋白酶的活性与肌球蛋白结合的效果。

肌钙蛋白I为单一多肽链，其相对分子质量随各亚型不同而异。肌钙蛋白I有三种亚型，由不同的基因编码，分别定位于骨骼肌快肌、慢肌以及心肌中。心肌肌钙蛋白I(cardiac-specific troponin I，cTnI)以两种形式存在于心肌细胞内：小部分(约3%)游离于胞质中，为可溶性；大部分以结构蛋白的形式固定于肌原纤维上，为不可溶性。正常人血液中cTnI的水平一般<0.3 μg/L，当肌细胞受到损伤时，游离的cTnI先释放入血，随着损伤加重，结合部分的cTnI被降解从而不断释放入血，导致血中cTnI持续升高。研究表明，成人的骨骼肌组织在任何阶段中都不表达cTnI，也不因任何病理刺激表达肌钙蛋白[10]。所以，cTnI有较高的心肌特异性，是检测心肌损伤和鉴定心肌源性细胞的特异性生化标志物，其表达阳性可以说明BMSCs发生心肌转化。张宇等[11]研究发现，通过免疫组织化学染色的方法检测到实验组胞质内出现棕黄色颗粒状复合物，呈阳性表达，而对照组呈弱阳性或阴性，从而确定5-氮胞苷能够诱导BMSCs向心肌细胞转化。

3 间隙连接蛋白43

心肌细胞的缝隙连接是心脏电生理一致性的物质结构基础。间隙连接蛋白43(connexin-43，Cx43)主要存在于心房和心室肌细胞连接处，在正常心脏组织细胞中表达。Cx43参与细胞间缝隙连接，是分化细胞与宿主细胞形成兴奋收缩耦联同步的蛋白质基础。Cx43基因DNA长约2768 bp，其中开放读码框为1146 bp，编码378个氨基酸的单肽，因其相对分子质量约为43×103，故命名为Cx43。Cx43是心肌细胞缝隙连接的特征性蛋白，其表达阳性说明心肌间闰盘的形成[12]。Cx43对于细胞间化学信息的交流和电冲动的传导，维持电活动和机械收缩、舒张功能的同步性，以及心肌功能的保持非常重要，是目前检测心肌闰盘的常用指标。贾敏等[13]在研究BMSCs分离培养及向心肌细胞转化的过程中，通过免疫细胞化学染色发现cTnT和Cx43表达阳性，说明分化的细胞具有心肌细胞特性。

4 肌细胞增强子2

肌细胞增强子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)属于转录调节因子MADS-Box家族，是一种特定的转录因子。在脊椎动物中，MEF2家族的转录因子有四个成员，分别是MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。MEF2蛋白的结构分为N端和C端，其N端在不同物种中几乎相同，都含有一个MADS-Box结构域和一个直接与其相邻的MEF2结构域。MADS-Box是由57个氨基酸组成的DNA结构域，不同脊椎动物中具有高度保守性。MEF2结构域由MADS-Box附近的29个氨基酸组成，是MEF2因子所特有的结构域[14]。MEF2C在心脏发育中表达，并且作为心脏特异性的转录因子参与心脏发育的各个过程，调节心脏特异性基因的表达。MEF2C与其他成员相比，其表达组织特异性比较显著。

5 心脏转录因子GATA结合蛋白4

GATA是一种组织特异性表达的转录因子家族。脊椎动物有6个GATA转录因子，其中心肌转录因子GATA-4在心脏发育最早期表达，是调控心肌基因表达的重要转录因子，参与了心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程，是心肌前体细胞最早的标志之一。人类GATA-4基因是一类含有锌指结构的组织特异性表达的转录因子，能结合共同序列(A/T)GATA(A/G)。GATA-4位于人类染色体8p23.1～p22，总长度为55 757 bp，有7个外显子，cDNA全长3372 bp，编码序列全长1329 bp。文通等[15]研究发现，BMSCs转染microRNA-1后，心肌重要转录因子GATA-4和MEF2C表达逐渐上调，转染后6 d，心肌特异性蛋白cTnI表达呈阳性，结果表明，microRNA-1能诱导BMSCs向心肌样细胞分化。

6 心肌早期转录因子Csx/Nkx2.5

Csx/Nkx2.5是背侧中胚层形成所必需的，它在心肌开始分化前即开始表达，是所有脊椎动物心脏发生中最早表达的转录因子，即心脏前体细胞最早的标志物。随着对心脏发育机制和相关信号通路研究的深入，人们发现MEF2C、Csx/Nkx2.5和GATA-4等转录因子可以作为心脏细胞分化过程中特异性的标志[16]。Vincentz等[17]的研究证实，Nkx2.5是心肌发育过程中起决定性作用的基因，MEF2C与Nkx2.5之间的相互作用对心脏(尤其是心室)发育至关重要。

伍长学等[18]的研究结果验证了电学因素在心脏发育过程中具有重要意义的理论假设,该实验结果显示，在各时间点5-氮胞苷诱导+电刺激组GATA-4、NKx2.5 和MEF2C基因表达量显著高于单纯5-氮胞苷诱导组，且两组的表达规律相似；通过蛋白定量分析发现，在各个时间点前组肌钙蛋白I、结蛋白、Cx43显著高于后组，通过这种对应关系，推测GTAT-4、NKx2.5和MEF2C基因参与调控心肌细胞的形成过程，而电刺激通过上调GATA-4、NKx2.5和MEF2C基因的表达，进而促进肌钙蛋白I、结蛋白和Cx43蛋白的表达和心肌细胞的形成。

7 超极化激活的核酸环化酶门控的离子通道

心肌组织的节律性活动(如心跳、呼吸等)均依赖于其中所含的一种能产生起搏电流的起搏细胞，这种电流最初由Di Francesco在20世纪80年代初研究兔窦房结起搏活动时发现，并称之为特种离子流。在此之前，Noma和Irisawa已经在研究窦房结起搏活动时发现这一离子流并命名为过渡激活正离子流，现称为超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization activated,cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)[19]。HCN所具有的超极化激活钠钾离子通道、细胞内环腺苷酸的调节及微弱的单通道电导等被认为是起搏活动所必须的独特特征，称为起搏电流[19]。在脊椎动物，HCN家族中包含4个成员，即HCN1、HCN2、HCN3、HCN4。HCN4基因位于人染色体15q23～q24上，全长共5065 bp，含有8个外显子，相对分子质量为129.1×103[20]。HCN基因家族中不同亚型的基本序列60%大体一致。HCN3特征性地仅在中枢中表达。HCN4基因的编码产物HCN4蛋白由1203个氨基酸组成，包含了6个跨膜部分(S1～S6)。HCN1、HCN2和HCN4在心脏中表达丰富，而根据原位杂交分析HCN的表达在窦房结中依次为HCN4>HCN2>HCN1。因此，可以通过检测HCN4、HCN2和起搏电流判定BMSCs分化为心肌细胞。

8 肌球蛋白重链

已知哺乳动物的心脏表达两种肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)，即α-MHC和β-MHC，这些基因表达产物在肌球蛋白分子中形成二聚体，存在3种分子异构体，即Vl(A-A同二聚体)、V2(A-B异二聚体)、V3(B-B同二聚体)。MHC具有两个生物学作用：一是具有腺苷三磷酸酶活性，裂解腺苷三磷酸，能够有效地将高能磷酸化合物分解释放的化学能转变成动能；二是具有与肌动蛋白结合的能力[21]。α-MHC见于胚胎型心肌细胞，而β-MHC在成熟心肌细胞中表达。β-MHC蛋白水平能够在一定程度上反映BMSCs向心肌细胞的分化情况，其基因表达水平是观察BMSCs向成熟心肌样细胞分化的重要指标之一[22]。冼绍祥等[23]在研究三七总皂苷对BMSCs增殖和向心肌样细胞分化的影响的实验中，分别检测正常大鼠心肌细胞和诱导前、诱导后4周细胞的α-MHC和β-MHC信使RNA的表达，发现经三七总皂苷、5-氮胞苷诱导24 h后继续培养，BMSCs能表达α-MHC 和β-MHC。

9 小 结

作为判定BMSCs诱导分化为心肌样细胞的检测指标结蛋白，α肌动蛋白、肌钙蛋白、Cx43、GATA-4等已经得到普遍应用，随着这些检测指标的应用，为BMSCs诱导分化为心肌样细胞提供了理论支持。然而BMSCs分化为心肌样细胞仍存在如何更好分离和纯化BMSCs、最佳诱导剂的选择、临床应用的安全性以及如何提高诱导分化率等问题。随着更多诱导剂的发现以及更有效的心肌特异性检测指标的研究，BMSCs诱导分化为心肌样细胞的前景会越来越广阔，干细胞移植将会给更多心脑血管疾病的患者带来福音。

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