人源化小鼠模型研究及应用进展

路 杰(综述)，崔凌凌(审校)

(青岛大学医学院附属医院痛风病重点实验室，山东青岛266003)

人源化小鼠模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的小鼠模型[1-2]。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景[3]。由于免疫缺陷小鼠缺乏免疫力，相对容易接受异种细胞或组织，作为人源化动物模型的应用性更强。目前，人源化小鼠模型已广泛应用于基础及临床研究，主要涉及肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和代谢性疾病等方面，而越来越多的新型人源化小鼠模型也在不断产生。

1 人源化小鼠模型研究概况

人源化小鼠模型的发展经历了三个里程碑式的阶段:第一阶段是重症联合免疫缺陷综合征(severe combined immunedeficient disease，SCID)小鼠模型。在 C.B-17近交系小鼠中发现，位于第16号染色体的单个基因隐性突变可导致小鼠出现SCID，称为SCID小鼠[4]。由于人类的外周血细胞、胚胎造血组织和肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)可移植到SCID小鼠体内，该小鼠适用于构建人源化动物模型。第二个阶段是非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)/SCID小鼠模型。由于NOD/SCID小鼠生命周期短，并且仍具有部分自然杀伤细胞活性，导致其作为人源化动物模型应用受限[5]。第三阶段是NOG(带有IL 2rg剔除基因的 NOD/Shi SCID)和NSG(带有IL 2rg剔除基因的NOD/LtSz SCID)小鼠模型。NOG和NSG小鼠是由白细胞介素2受体γ链(interleukin 2 receptor gamma chain，IL-2Rγ)靶向突变形成的免疫缺陷小鼠，该类小鼠适用于构建多种人源化小鼠模型，其应用领域包括肿瘤、血液系统疾病、感染性疾病、免疫性疾病及代谢性疾病等[6]。

2 适宜构建人源化模型的小鼠品系

目前适于建立人源化模型的免疫缺陷小鼠品系主要包括裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NOG小鼠、NSG小鼠模型[3]等。各个品系的小鼠具有不同的生物学特性。

2.1 裸鼠 裸鼠是一种无胸腺、无毛的变异小鼠，由于第11号染色体上的等位基因突变导致其胸腺先天性缺失，依赖胸腺的免疫系统功能不全[7]。裸鼠与不同纯系小鼠交配，可获得多种突变系。在我国使用较多的裸鼠品系有 BALB/c-nu、Swiss-nu、NC-nu、NIH-nu等。

2.2 SCID小鼠 1983年Bosma等[4]于近交系C.B-17小鼠中发现SCID小鼠。SCID小鼠表现为缺乏成熟的功能性T、B淋巴细胞及低免疫球蛋白血症。造成SCID小鼠出现严重免疫缺陷的最主要原因是纯合SCID基因突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ编码顺序的重组酶活性异常，故不能有效地合成免疫球蛋白与T细胞受体。但由于SCID小鼠的自然杀伤细胞及巨噬细胞功能是正常的，且有2%～23%的小鼠出现淋巴细胞免疫功能恢复(即渗漏现象)，在一定程度上影响了SCID小鼠的广泛应用[8]。

2.3 NOD/SCID小鼠 为提高人类异种细胞移植的成功率，Shultz等[5]于1995年将SCID突变基因导入到NOD小鼠身上获得NOD/SCID小鼠。该小鼠的特点是缺乏功能性自然杀伤细胞和循环补体，功能性抗原呈递细胞分化障碍。由于NOD/SCID小鼠具有T、B淋巴细胞缺失及自然杀伤细胞部分缺失等特点，其应用范围更广。

2.4 NOG、NSG小鼠 小鼠重组酶激活基因Rag2缺失后可阻碍T、B淋巴细胞的产生。T、B淋巴细胞及自然杀伤细胞的发育、成熟需要一些重要的细胞因子的参与，如IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21等，这些细胞因子具有共同的白细胞介素受体——IL-2Rγ。NOD/SCID小鼠剔除 IL-2Rγ基因后，获得NOD/SCIDγc－/－小鼠，该小鼠也表现为T、B细胞及自然杀伤细胞完全缺失[1]。根据 IL-2Rγ中 γ链突变的不同，NOD/SCIDγc－/－小鼠又分为NOG和NSG小鼠，前者是γ链信号区截短，而后者则是γ链的胞内信号完全突变[9]。研究数据显示，NOG、NSG小鼠是目前可以接受人类细胞和组织移植的最优模型，这两种模型的移植成功率高于SCID和NOD/SCID小鼠模型[10-11]。NOG、NSG小鼠的另一个重要优势是不发生渗漏现象和自发性胸腺瘤，这可能与其缺乏有活性的IL-2Rγ有关。

2.5 其他类型人源化免疫缺陷小鼠 近年来也有其他几种新型的免疫缺陷小鼠用于构建人源化动物模型，如人外周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte，Hu-PBL)-SCID小鼠可移植来自人类血液、脾脏或淋巴结的成熟外周单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，主要用于研究人类成熟免疫细胞的功能;Hu-SRC-SCID小鼠可用于移植人类HSC;SCID-Hu和人类转基因(Hu-Tg)表达小鼠可用于移植人胎肝和胸腺等[3]。这些免疫缺陷小鼠的出现为构建人源化动物模型、研究人类疾病提供了良好的平台。

3 人源化小鼠模型的应用研究

3.1 人源化小鼠模型在肿瘤方面的研究进展 第一个人源化肿瘤模型是以裸鼠为基础构建的。C.B17-SCID小鼠可以接受某些人类血液肿瘤的移植，但肿瘤的生长受到宿主高水平自然杀伤细胞活性的限制。后来发展的人源化小鼠模型逐步克服了这一缺点。由于NOG小鼠更利于肿瘤细胞快速生长，多代遗传后仍较稳定，且相对于NOD/SCID、C.B17-SCID小鼠有较高的移植成功率，因此该品系小鼠已成为肿瘤研究方面的主要模式动物。但某些人类肿瘤细胞，如前列腺癌细胞，仍难以在该类小鼠中存活。具体原因未明，一方面可能是由于肿瘤细胞系对于传统免疫缺陷小鼠的适应，另一方面也可能是无活性的IL-2R影响了某些肿瘤细胞在NOG小鼠中的生长。

肿瘤细胞与来自不同个体的造血细胞之间人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的不匹配可能会引起严重的移植物抗宿主病或反应缺失，因此要成功构建对肿瘤细胞具有有效免疫反应的小鼠模型，前提是HLA的匹配。近期，Shultz等[12]报道，通过转入 HLA匹配的人类 HSC来构建HLAⅠ类(A2)转基因NSG小鼠。这些小鼠的发展为研究肿瘤的免疫性治疗提供了良好模型。此外，研究者将人类组织移植到免疫缺陷小鼠中可用于研究肿瘤的形成。例如，将经紫外线照射的人的皮肤组织移植入小鼠会导致TP53和RAS基因的突变，可用于鳞状细胞癌的研究[13]。人源化小鼠模型也适用于研究抑制肿瘤生长治疗方法，包括制备血管生成抑制剂、人源化抗体、免疫抑制剂、肿瘤生长因子抑制剂等。为研究肿瘤发生的整个体内过程，研究者将带有特定原癌基因的质粒导入人类HSC中，这些研究可明确肿瘤发病过程中的关键调控点，为临床提供有效的干预性治疗[14-15]。利用人的正常及癌前病变组织能够在小鼠体内生长这一特点，可建立人源化动物模型，开展肿瘤转移扩散方面的相关研究。

在混合性白血病(mixed acute leukemia，MLL)研究方面，以往的白血病小鼠模型是将人的白血病细胞注入免疫缺陷小鼠体内，用以观察人类白血病的病理过程[16-17]。然而，由于白血病细胞在注入小鼠体内前就已经在白血病患者体内完成了发育分化，不能用这些模型来研究白血病的病理过程，包括发生过程和发展过程。Barabe等[18]证实，MLL-麻风结节性红斑或AF9异位表达可在NOD/SCID小鼠模型中引起白血病。与之类似，Wei等[19]将MLL-AF9基因转入HSC中，并将这些细胞注入NOD/SCID小鼠模型中，该模型可表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和 IL-3基因。近期，Moriya等[20]利用NOG小鼠模型发现MLL-AF10基因可提高人类的多系造血HSC数量，并且将MLL-AF10基因与活性K-ras基因共同转染小鼠来诱导急性单核细胞白血病M5型(法美英FAB分型)的发生。这些人源化小鼠为研究白血病发病机制以及药物筛选提供了一个全新而理想的模型。

3.2 人源化小鼠模型在感染性疾病方面的研究进展 感染性疾病是由病原微生物造成，但许多传染病，如获得性免疫缺陷综合征、疟疾、丝虫病以及登革出血热等的病原体并不感染小鼠等实验室动物，因此限制了通过动物模型进行的活体研究。人源化小鼠模型的出现为研究这类疾病及开展疫苗测试提供了一个有效平台。随着新型的人源化小鼠模型的出现，一系列用于研究传染病的动物模型陆续构建成功，包括用于研究登革热病毒、EB病毒、丙型肝炎病毒、结核分枝杆菌等的模型[1]。

3.2.1 基于人类免疫系统小鼠的感染性人源化小鼠模型通过将人造血祖细胞和(或)外周血细胞悬浮液(带有支持人免疫细胞生长的血细胞周围组织)移植入免疫缺陷小鼠可获得人类免疫系统(human immune system，HIS)小鼠。HIS小鼠作为唯一可被人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的动物模型，可用于测试抗病毒化合物。此外，HIV不仅可通过静脉途径感染该类小鼠模型，也可经阴道、直肠途径导致感染发生。但是，病原体感染HIS小鼠所引起的免疫反应仍然不够理想。例如，破伤风类毒素免疫接种在HIS小鼠体内产生的抗体含量低于成人体内抗体含量。HIV感染小鼠后，只有少量的病毒特异性抗体产生，并且也未见HIV感染引起的特异性T细胞反应。EB病毒感染HIS小鼠可活化T细胞和B细胞，但也可进展为B细胞淋巴瘤，表明该小鼠模型无法控制感染程度[21]。目前，HIS小鼠中的总人体细胞数仍低于预期水平，IgM和IgG血清抗体滴度也远远低于人类。HSC不能稳定地保持在一定水平上，且会分化成为无效祖系。因此，人源化小鼠与人体还有一定的差距，仍需改进才可用于筛选人类疫苗。改进HIS小鼠的重建方式包括:消融内源性小鼠亚群来为人类细胞提供“生存空间”;提供外源性细胞因子来消除人鼠之间的生物交叉反应;令小鼠表达人主要组织相容性复合物分子等。应用此类小鼠模型进行的疫苗试验将更适于模拟人类体内反应，更有效地筛选出临床所用疫苗[22]。

3.2.2 HIV方面的研究进展 早期研究发现，在 C.B17-SCID小鼠体内输注PBMC或者HSC就可促使HIV感染小鼠，但由于人细胞的组成水平低且不稳定，这些人源化小鼠模型的应用有限。由于HIV-1可以感染SCID-Hu小鼠模型中的人源化T淋巴细胞，该模型已经广泛应用于分析疾病的发病机制 和 抗 HIV-1 药 物 的 研 发[23]。 由 Olesen 等[24]和Choudhary等[25]报道的一种特殊类型的HIV-1模型逐渐受到研究者的关注。这种模型是将人的胚胎骨髓、肝脏及胸腺组织移植入小鼠肾被膜下，获得骨髓-肝脏-胸腺小鼠。骨髓-肝脏-胸腺小鼠模型的最大特点是重建人的黏膜免疫，而这在以往移植了人的HSC小鼠模型中还未见报道。这些重建的黏膜免疫包括派尔集合淋巴结和肠源性淋巴组织。该模型在一定程度上促进了黏膜免疫研究方面的发展。同时，Olesen等[24]和 Choudhary等[25]还发现，IL-2Rγ 基因并不依赖于黏膜淋巴系统，提示黏膜免疫不能在含有突变型IL-2Rγ基因的NOG或NSG小鼠模型中构建出来。

3.2.3 疟疾方面的研究进展 疟疾是一种全球感染性疾病，因而急切需要一种理想的动物模型来开发疟疾相关疫苗[26]。疟原虫主要经肝脏致病，已有报道显示，将人的肝脏实质细胞注射入肝脏受损的免疫缺陷小鼠体内，人的肝细胞就可替代小鼠的肝细胞存活[27-28]。同时，由于人的红细胞不能由HSC分化而来，需经小鼠腹膜注入人的红细胞，以观察疟原虫在肝内的增殖情况[29-30]。只有构建出人红细胞长期维持并在外周血管中流动的小鼠模型，才能观察到疟原虫在体内的整个生命过程[31-32]。

3.2.4 人源化肝鼠嵌合模型 由于小鼠免疫系统可以抵抗肝炎病毒的侵袭，大多数小鼠不能表现感染性肝脏疾病，这限制了传统人源化肝鼠嵌合模型的发展。Mercer等[33]成功构建了第1例人源化肝嵌合体小鼠模型，即SCID/bg小鼠。该小鼠模型因带有尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子(uridylyl phosphate adenosine，uPA)基因，因而可致肝细胞死亡。为提高人肝细胞体外移植率，NOG-uPA[34]和 FRG(Fah/Rag2/IL-2rg)小鼠模型不断被改进，已显示这两种小鼠模型的移植率达到80%以上。但仍存在一些问题限制此类模型的发展，如将人肝细胞移植入小鼠体内可能导致肾脏疾病及移植时间窗较窄等。最近，Hasegawa等[28]构建了一种新型NOG亚系的小鼠模型，该模型在白蛋白启动子的调控下表达单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因。其较uPA基因依赖性小鼠模型有更高的肝细胞移植率并且不发生肝、肾疾病。这一模型的出现有利于药动学、毒理学和肝炎病毒研究方面的发展。Bility等[35]近期在BALB/c-RAG2-γ C-null免疫缺陷小鼠基础上构建出一种新的人源化肝鼠嵌合模型，即AFC8人源化小鼠模型，该模型带有肝脏特异性基因且具有诱导凋亡的活性。AFC8小鼠模型具有功能性人类免疫系统，在注射了从人类胎肝组织提取的 CD34+HSC及肝起源细胞(hepatic progenitor cells，Hep)后，即形成AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型。此模型的最大优势就是小鼠肝脏可以受丙型肝炎病毒感染及产生抗丙型肝炎病毒的人T细胞反应。另外，丙型肝炎病毒感染导致的肝炎和肝纤维化与人星状细胞活性及人致纤维化基因有关。AFC8-hu小鼠是一种非常好的研究乙肝、丙肝病毒体内感染最终致肝纤维化全过程的模型。

3.3 人源化小鼠模型在自身免疫性疾病方面的研究进展对于人自身免疫性疾病的研究主要存在两方面的问题:一方面现有的干预措施有限，另一方面难以对目标器官和组织开展直接研究。为了解决这一问题，科研人员建立起了两种人源化小鼠模型:一种是将患者的PBMC输入SCID小鼠形成的Hu-PBL-SCID人源化小鼠模型;另一种是HLA转基因的小鼠模型。这两种模型被广泛应用于一些自身免疫紊乱疾病(如多发性硬化症)的研究及确定潜在的T细胞自身抗原作用靶点。为研究甲状腺疾病(如Graves病)，可将患者的PBMC输入 C.B17-SCID 小鼠体内。当在 C.B17-SCID Rag2－/－小鼠上移植具有Graves病患的甲状腺组织及其PBMC就会出现针对甲状腺过氧化物酶特异性的自身抗体，这为成功构建自身免疫性疾病小鼠模型提供了基础[36]。

在研究人类类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)方面，与人RA较为相似的小鼠模型是一种表达HLA-DRβ1*0401(DR4)的转基因小鼠，该类小鼠模型在胶原蛋白或瓜氨酸多肽的刺激下可产生类风湿样疾病。但由于该模型与传统模型一样，仍表达抗原共表位，因而在应用上受到限制。Misharin等[37]将脐带干细胞移植入受辐射的1日龄NSG小鼠构建出新的人源化小鼠模型。该模型最大的特点是具有人类天然免疫和适应性免疫的双重免疫。人类的白细胞可在该品系小鼠体内转移至初级和次级淋巴器官，并引起相应组织的无菌性炎症。亦有通过药物作用于RA小鼠模型来反馈性研究RA的病理变化，调整用药方法和剂量，达到最佳治疗状态，结果显示比较理想[37]。甲氨蝶呤是较常用的治疗类风湿性关节炎的药物，研究发现，甲氨蝶呤能够诱导小鼠模型中巨噬细胞凋亡和滑膜成纤维细胞减少[37]。近年来利用RA-SCID鼠嵌合体模型开展的基因治疗获得了引人注目的结果，证实移植的滑膜可转染IL-1Rα、肿瘤坏死因子α，核因子κB基因，转染这些基因后，滑膜细胞大量凋亡，同时软骨侵蚀显著甚至滑膜组织消失。另外，通过这种模型发现了凝血酶敏感素2，其作为一种内源性血管形成因子和自身免疫性炎症调节因子，具有对抗RA侵袭的作用[38-39]。

3.4 人源化小鼠模型在糖尿病方面的研究进展 在研究人类胰岛功能方面应用最为广泛的小鼠模型是将患者胰岛组织移植到小鼠体内并监测血糖水平，但该模型存在诸多弊端，如异体排斥等。King等[36]最近构建出新型高血糖型人源化免疫缺陷小鼠模型——Akita小鼠模型，该模型可耐受Ins2Akita基因突变，导致胰岛蛋白2(该蛋白可致内质网应激及胰岛β细胞凋亡)不折叠，从而使小鼠在3～6周龄时自发高血糖症。另一个模型是转基因(RIP-Hu DTR)小鼠模型，即将白喉毒素注入小鼠体内，引发小鼠表达人白喉毒素受体，白喉毒素可特异性地杀伤鼠胰岛β细胞并致高血糖症。

在糖尿病的细胞治疗方面，人源化小鼠模型的应用发展迅速，已成功的将人胰岛细胞移植入小鼠体内的临床试验。由于胰岛细胞供不应求，人们通过干细胞来培育分化胰岛β细胞。为保证细胞治疗的安全性和有效性，需要有更合适的人源化动物模型开展相关实验。例如，可自发产生非自身免疫性高血糖症的 NOD-Rag1－/－Prf1－/－Ins2Akita小鼠模型，该类模型可用于检测人类β干细胞体内功能。NOD-Rag1－/－Prf1－/－小鼠通过与Ins2Akita小鼠回交后得到新的品系，人类β干细胞可移植入该小鼠模型体内，并且可以耐受功能性人类免疫系统，这与临床上将外源胰岛细胞植入病人体内类似[2]。

3.5 人源化小鼠模型在痛风方面的研究进展 痛风是一种常见的代谢性疾病，是尿酸钠晶体在关节内及其周围组织广泛沉积所引起的急慢性非感染性炎性反应。由于人类在进化过程中基因突变，导致了尿酸氧化酶基因失活，这也是人类易患痛风的重要原因。而包括小鼠在内实验动物，尿酸代谢主要依赖体内的尿酸氧化酶，因此人类和小鼠在尿酸代谢和排泄上明显不同，利用普通小鼠模型所得到的实验结论与人体实际情况存在差异。有关资料显示，尿酸氧化酶基因剔除后，小鼠可出现高尿酸血症和痛风症状，成为与人类痛风发病机制非常相似的自发性高尿酸血症和痛风小鼠动物模型[40]。但该模型仍存在缺陷:尿酸氧化酶基因缺失的纯合子小鼠超过一半死于出生后4周内;该基因剔除小鼠背景为129品系，具有免疫排斥，无法在小鼠体内模拟人类的发病过程。SCID小鼠可接受人体正常组织的移植，也可以接受人体免疫细胞移植，进行免疫功能重建。将正常人体关节滑膜组织移植到SCID小鼠背部，4～6周后将形成人关节滑膜组织-SCID小鼠嵌合体[41]。因此，把人的关节滑膜植入剔除尿酸氧化酶基因的SCID小鼠背部，并向该小鼠体内注入人的免疫细胞将成为更符合人类痛风发病特点的人源化小鼠模型。

在尿酸氧化酶基因剔除方法上，既可以采用传统的Red/ET重组打靶技术，也可以通过较为先进的转录激活因子样效应物核酸酶技术及回文重复序列集关联蛋白系统。痛风人源化小鼠模型在开展痛风发病机制研究及药物筛选方面具有广阔的应用前景。

4 结语

人源化小鼠模型作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。筛选出更符合构建人源化小鼠模型需要的免疫缺陷小鼠，是提高人源化动物模型应用的关键，因此仍需进行更为深入的研究。结合现有的人源化小鼠模型构建技术，模拟人体的生理、病理变化，可以为临床应用提供新的途径，实现技术转归，从而更好地服务于人类。

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