急性冠状动脉综合征患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和P选择素水平的变化

任澎 张冰 马丽 刘永国 莫红梅 李秀

.临床研究.

急性冠状动脉综合征患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa和P选择素水平的变化

任澎 张冰 马丽 刘永国 莫红梅 李秀

目的 探讨急性冠状动脉综合征(ACS)患者血小板聚集功能及抗血小板治疗对其影响。方法 入选ACS患者40例,分为不稳定型心绞痛组(26例)和急性心肌梗死组(14例),采用流式细胞术测定ACS患者应用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治疗前后血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa (PAC-1)和P选择素(CD62P)水平的变化,并与疑诊冠心病但冠状动脉造影检查正常的对照组(30例)进行比较。结果 治疗前,不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者PAC-1、CD62P的表达率(%)均高于对照组(PAC-1：62.47±3.91和67.91±10.42比32.46±8.93；CD62P：16.73±3.74和18.53± 5.62比7.67±2.21,均为P＜0.05),经双重抗血小板治疗5 d后,两组PAC-1、CD62P的表达率(%)较治疗前均明显降低(PAC-1：43.62±9.67比62.47±3.91,46.55±4.86比67.91±10.42,均为P＜0.05；CD62P：12.38±3.29比16.73±3.74,13.39±3.41比18.53±5.62,均为P＜0.05),但仍高于对照组(均为P＜0.05)。结论 ACS患者应用阿司匹林及氯吡格雷双重抗血小板治疗,可有效抑制血小板活化。

急性冠状动脉综合征； 流式细胞术； P选择素； 血小板膜糖蛋白类

急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)主要是在冠状动脉粥样硬化斑块破裂的基础上血栓形成,导致完全或不完全堵塞冠状动脉而引起的一组临床综合征。血小板黏附、活化和聚集在动脉粥样硬化的进展和心血管事件的发生中起着关键性作用［1］。在临床治疗上,抗血小板治疗是ACS治疗中最重要措施之一。血小板膜表面及其细胞器存在多种糖蛋白。血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa (PAC-1)是血小板膜含量最多的糖蛋白,在血小板的黏附、聚集及释放反应中起重要作用。与纤维蛋白原等结合是血小板聚集过程中的最后共同途径,因此,检测血小板膜表面PAC-1的表达可直接反映血小板活化聚集状态。P选择素(CD62P)是存在于静止血小板颗粒膜上的一种蛋白质,活化血小板的颗粒迅速与血小板膜融合释放,使CD62P在血小板表面重新分布,因而,CD62P在血小板膜表面的表达也是血小板活化的特异性标志物。本研究应用流式细胞术测定ACS患者PAC-1和CD62P水平,以及应用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治疗后的变化。

1 对象和方法

1.1 一般资料

入选2009年3月至2011年12月我院心内科住院并行冠状动脉造影的患者70例,年龄38～71岁。其中ACS组患者40例,包括不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris,UAP)患者26例,其中男性15例,女性11例,年龄45～71岁,平均(39.2± 6.3)岁；急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)患者14例,其中男性9例,女性5例,年龄38～67岁,平均(57.4±9.1)岁。对照组30例,年龄39～70岁,平均(54.6±8.2)岁,两组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

入选标准：(1)ACS组患者符合《中国冠心病诊断与治疗指南》UAP或ACS诊断标准,且冠状动脉造影提示至少一支冠状动脉血管病变狭窄程度≥50%；(2)对照组为疑诊冠心病但冠状动脉造影检查正常者；(3)所有入选者在试验前均未应用阿司匹林、氯吡格雷等影响血小板功能的药物。

排除标准：(1)阿司匹林过敏者；(2)已接受阿司匹林和(或)GPⅡb/Ⅲa抑制剂治疗者；(3)有严重的肝肾功能异常或其他器官功能不全者；(4)有明确的病毒、细菌感染,急慢性炎症性疾病；系统性炎症性疾病(系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等)；出血性疾病者；(5)肌病/肌病进展期,肿瘤,合并栓塞性疾病或周围血管性疾病者。

1.2 主要仪器及试剂

主要仪器：FACS Calibur流式细胞仪,激光光源为15 mW的氩离子激光；一次性12×75 mm Falcon管,美国BD公司。主要试剂：(1)PAC-1,为异硫氰酸荧光素标记的抗GPⅡb/Ⅲa单克隆抗体；(2) CD62P-PE,为藻红蛋白标记的抗CD62P单抗；(3) CD61 PerCP,为多甲藻黄素叶绿素蛋白标记的活化CD61单抗；(4)Mouse γ1 Isotype control PE,为CD62P的同型对照。以上试剂均购自美国BD公司,2～8℃保存；(5)四肽RGDS(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-丝氨酸四肽,ARG-GLY-ASP-SER),PAC-1阻断剂,用以PAC-1的阴性质控,购自美国SIGMAAIDRICH公司。

1.3 检测方法

所有入选者均在入院后应用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治疗前,于清晨空腹相同时间采用采血针及BD VacutainerTM真空采血管采集肘正中静脉血5 ml。ACS组于应用阿司匹林和氯吡格雷抗血小板治疗5 d后在清晨空腹相同时间再次抽取静脉血进行检测。抽取血液标本时不扎止血带,弃去前2 ml可能混有组织液的血液,轻轻混匀,避免采血管剧烈摇动,以减少采血过程中人工激活。采血后20 min内完成标本的标记及固定步骤。将流式管标号以区分对照管和试验管。用移液器向各对照管中加入PAC-1、CD61 PerCP、Mouseγ1 Isotype control PE各10 μl,RGDS 5 μl,试验管中加入PAC-1、CD62PPE、CD61 PerCP各10 μl,混匀后向上述试管中各加入血液标本5 μl,轻轻混匀,避光室温孵育15 min。各管中加入预冷的固定液(1%多聚甲醛,2～8℃) 1 ml并轻轻混匀。放置于冰箱2～8℃避光30 min。标本制备完成后24 h内应用流式细胞仪检测分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组治疗前PAC-1、CD62P水平

UAP组患者抗血小板治疗前PAC-1和CD62P的表达率分别为62.47%±3.91%和16.73%± 3.74%；AMI组PAC-1和CD62P的表达率分别为67.91%±10.42%和18.53%±5.62%；对照组PAC-1和CD62P的表达率分别为32.46%±8.93%和7.67%±2.21%。应用方差分析比较,对照组、UAP组和AMI组之间PAC-1和CD62P的表达率差异有统计学意义(均为P＜0.05)。进行两两比较, UAP组和AMI组均明显高于对照组,差异有统计学意义(均为P＜0.05),而UAP组与AMI组之间差异无统计学意义(均为P＞0.05),见表1。

表1 各组治疗前后PAC-1和CD62P表达率变化(%)

2.2 ACS组治疗后PAC-1、CD62P水平变化

UAP组患者抗血小板治疗后PAC-1和CD62P的表达率分别为43.62%±9.67%和12.38%± 3.29%；AMI组PAC-1和CD62P的表达率分别为46.55%±4.86%和13.39%±3.41%,较治疗前明显下降,差异有统计学意义(均为P＜0.05),但仍高于对照组(均为P＜0.05)。UAP组与AMI组之间差异仍无统计学意义(均为P＞0.05),见表1。

3 讨论

大量研究证实,血小板活化在冠状动脉粥样硬化发生发展、UAP及AMI冠状动脉血栓形成过程中起着至关重要的作用［2］。检测体内有无血小板活化及其程度对于冠心病的诊断具有重要意义。活化血小板颗粒膜蛋白在质膜上的高水平表达可引起GPⅡb/Ⅲa及CD62P的显著性改变［3］。血小板GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原等相结合是各种血小板激动剂导致血小板凝集过程中的最后共同途径,因此,检测血小板膜表面GPⅡb/Ⅲa的表达可直接反映血小板活化聚集状态［4］。CD62P是存在于静止血小板α颗粒膜上的一种蛋白质,可以介导血小板黏附血管内皮细胞,激活中性粒细胞,释放血管活性物质和氧代谢产物,导致血管收缩,阻塞小血管启动血栓形成过程,在冠心病的发生发展中起着非常重要的作用。当血小板被活化时,血小板胞质内处于静止期的CD62P随着活化血小板的“脱颗粒”发生易位,与质膜相融合,在血小板膜表面大量表达,成为识别活化血小板的特异性标志物［5］。参与血小板的第二相聚集,在启动和扩大血栓形成中具有重要意义。

ACS的病理基础是冠状动脉粥样硬化斑块破裂后,血管内皮下胶原组织暴露,随之发生血小板黏附聚集和血栓形成,造成冠状动脉阻塞。血小板的功能在此过程中起着关键的作用。研究显示,心血管疾病患者抗血小板治疗可以有效减少动脉粥样硬化事件的发生,对于进行了冠状动脉血运重建术的患者也可以减低术后冠状动脉事件的发生率［6］。动物实验也表明,抗血小板治疗可以减轻AMI引起的缺血及再灌注损伤［7］。本研究采用流式细胞术测定UAP和AMI患者入院时及经双重抗血小板治疗5 d后PAC-1和CD62P的表达率,并与对照组相比较,发现ACS患者(包括UAP和AMI)联合抗血小板治疗前后血小板PAC-1和CD62P的表达均明显高于对照组(均为P＜0.05),表明AMI患者有明显的血小板活化,提示ACS患者体内血小板的黏附、聚集、释放反应均增高,是血栓形成的高危患者。相关文献也报道,冠心病患者冠状动脉病变程度与PAC-1阳性表达率呈正相关,心肌梗死患者血小板活化率明显增高［8］。阿司匹林和氯吡格雷等抗血小板药物是目前心肌梗死等冠状动脉疾病关键的预防和治疗药物［9］。研究发现,UAP组及AMI组抗血小板治疗后血小板活化程度较治疗前明显下降,但仍高于对照组,表明阿司匹林和氯吡格雷联合抗血小板治疗可有效降低血小板活化状态,但不能完全消除致血小板活化因素,其机制是由于动脉粥样硬化斑块的形成,使血小板活化因素无法逆转,血小板长期处于活化状态,因而需要长期抗血小板治疗预防血栓形成［10］。本研究还发现,对照组的血循环中,PAC-1和CD62P有低水平的表达,与蔡俊明等［11］的研究一致,这可能是机体维持凝血-抗凝系统功能平衡的生理现象。

本研究表明,PAC-1和CD62P的表达率能反映血小板聚集功能,ACS患者体内血小板处于高度活化状态,应用阿司匹林及氯吡格雷双重抗血小板治疗可有效抑制血小板活化,但不能完全消除致血小板活化因素,需要长期抗血小板治疗预防血栓形成。

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Changes of platelet glycoproteinⅡb/Ⅲa and P-selectin in patients with acute coronary syndrome

Ren Peng1,Zhang Bing2,Ma Li1,Liu Yongguo1,Mo Hongmei3,Li Xiu3.
1 Department of Cardiology,the Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital,Urumchi 830001,China；2 Department of Clinical Laboratory；3 Department of Emergency,the Affiliated Hospital of Binzhou Medical School

Objective To investigate the changes of platelet glycoproteinⅡb/Ⅲa(PAC-1)and P-selectin(CD62P)in patients with acute coronary syndrome(ACS)and the influence of antiplatelet therapy. Methods Forty ACS patients were divided into UAP group(n=26)or AMI group(n=14)and 30 normal subjects as control group.Platelet membrane PAC-1 and CD62P were measured by flow cytometry in ACS patients before and after antiplatelet therapy with aspirin and clopidogrel,and then compared with normal control group.Results The expression levels of PAC-1 and CD62P in patients with ACS were significantly higher than those in controls(62.47±3.91 vs.32.46±8.93；67.91±10.42 vs.32.46±8.93；16.73± 3.74 vs.7.67±2.21；18.53±5.62 vs.7.67±2.21；all P＜0.05).PAC-1 and CD62P expression levels were significantly decreased after 5 days of antiplatelet therapy(43.62±9.67 vs.62.47±3.91；46.55± 4.86 vs.67.91±10.42；12.38±3.29 vs.16.73±3.74；13.39±3.41 vs.18.53±5.62,all P＜0.05), but still higher than controls(all P＜0.05).Conclusions Aspirin and clopidogrel dual antiplatelet therapy can effectively inhibit platelet activation in patients with ACS.

Acute coronary syndrome； Flow cytometry； P-Selectin； Platelet membrane glycoproteins

Ren Peng,Email：renpengcvd@163.com

2013-09-28)

(本文编辑：谭潇)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.03.005

830001乌鲁木齐,新疆维吾尔自治区人民医院心内科(任澎、马丽、刘永国),检验科(莫红梅、李秀)；滨州医学院附属医院急诊科(张冰)

任澎,电子信箱：renpengcvd@163.com