一种EGCG单体纯化新工艺

黄磊，杨军国，付杰，夏小欢，裘珺琳，陈旭东

（1.绍兴市农业科学研究院，浙江 绍兴 312000; 2.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

一种EGCG单体纯化新工艺

黄磊1，杨军国2，付杰1，夏小欢1，裘珺琳1，陈旭东1

（1.绍兴市农业科学研究院，浙江 绍兴 312000; 2.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015）

以粗酯型儿茶素为原料，研究采用大孔吸附树脂和结晶纯化儿茶素单体EGCG的制备工艺。通过比较4种大孔吸附树脂对EGCG的吸附和解吸能力，筛选出最优树脂AB-8，并考察乙醇梯度洗脱等特性，再经过结晶析出EGCG晶体。结果表明：AB-8大孔吸附树脂对EGCG具有较好的吸附选择性，通过10%乙醇洗脱，EGCG产品纯度从54.41%提高到了92.65%，得率达93.38%，结晶后得纯度达98%以上的EGCG单体。

EGCG；大孔吸附树脂；结晶；纯化

茶叶的主要有效成分茶多酚（Tea polyphenols，TP）具有抗肿瘤、抗衰老、抗心脑血管疾病及抑制艾滋病毒（HIV病毒）的作用[1-8]，并能有效抑制细菌生长[9]、防止食物腐败变质，且具备消除异臭、水溶性强等特征，因而被广泛用于生物保健食品、化妆品、日用化工、轻化工等领域[10]。儿茶素是茶多酚的主体成分，其中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）在功效上强于其他儿茶素组分，现已成为儿茶素分离、纯化与临床应用研究的焦点，并被美国列为一种潜在的抗癌药物进行研究开发[11-13]。我国的茶叶资源丰富，运用现代科技将EGCG开发成天然的保健食品和药物，具有巨大的社会效益和经济效益。

目前，儿茶素及其氧化产物的分离纯化方法主要有高效液相制备色谱法[14-15]、柱层析法[16-21]、高速逆流色谱法（HSCCC）[22-24]等，其处理过程繁杂，设备及材料昂贵，产量不高，不适合工业化生产。树脂吸附法提取儿茶素具有高效、安全、无毒、可持续生产的特点，较适合大规模生产。本研究考察4种不同性质的大孔吸附树脂对EGCG的分离纯化效果，同时结合单次结晶得到高纯度的EGCG单体，从而可为其大规模生产提供工艺参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）系中国药品生物制品检定所提供，纯度≥98%；粗酯型儿茶素样液参考文献《大孔吸附树脂富集酯型儿茶素》[25]方法自制，其中EGCG纯度54.41%，ECG纯度14.45%；其余均为色谱纯或分析纯试剂。所选大孔吸附树脂和脱色树脂性质特征见表1。

主要仪器和设备：2795高效液相色谱（美国Waters公司）；Luna 5u Pheny1-Hexy1色谱柱（250 mm×4.60 mm，5micron，广州菲罗门科学仪器有限公司）；LGJ-20F真空冷冻干燥机（欧瑞康莱宝真空设备（天津）有限公司）；Φ3.5 cm×50 cm玻璃层析柱，Φ8.4 cm×40 cm玻璃层析柱（上海楚柏实验室设备有限公司）；Beckman Allegra 64R冷冻离心机（美国贝克曼公司）。

表 1 不同大孔吸附树脂的理化特性Table 1 Physical and chemical properties of different macroporous adsorptive resins

1.2 静态吸附和解吸

树脂预处理：用95%的乙醇溶液浸泡大孔吸附树脂24 h，使其充分溶胀。湿法装柱于玻璃层析柱中，再用95%的乙醇淋洗，待洗出液不浑浊时改用重蒸水淋洗，洗至无明显乙醇气味即可（此时乙醇浓度低于5%）。准确称取HPD826、LX-17、AB-8、XAD-16N树脂各30 g（干重），湿法装柱于φ3.5 cm ×50 cm玻璃层析柱，将酯型儿茶素配制成一定浓度的溶液，以1 BV/h的流速进行动态吸附，当上述树脂动态吸附饱和后（流出液酯型儿茶素浓度为上样液浓度的5%时可以视为吸附饱和），水洗除去部分水溶性杂质。配制10%～50%不同梯度的乙醇洗脱液各2 BV，以2 BV/h 流速进行洗脱，按每一个梯度进行分段收集，并用HPLC检测EGCG和ECG的浓度，方法参照GB/T 21727—2008《固态速溶茶儿茶素类含量的检测方法》测定。

1.3 树脂动态洗脱实验

1.3.1 动态吸附

选用Φ3.5 cm×50 cm玻璃层析柱，称取50 g目的树脂湿法装柱，以1 BV/h，2 BV/h，3 BV/h的流速分别进样，实验时将酯型儿茶素浓缩液稀释后上柱，每1 BV分段收集，并用HPLC分析，作出吸附穿透曲线。

1.3.2 动态洗脱

按上述吸附流速使树脂吸附饱和，以梯度洗脱所得的最佳浓度乙醇溶液洗脱，洗脱流速1 BV/h，2 BV/h，3BV/h，每1 BV分段收集，HPLC分析每段EGCG浓度，作出洗脱曲线。

1.4 树脂中试试验

称取750 g树脂（约1350 ml）湿法装柱于Φ8.4 cm×40 cm玻璃层析柱中，以最佳吸附速度上样酯型儿茶素样液5 L（其中EGCG浓度4.1184 mg/ml，ECG浓度1.2169 mg/ml），再以最佳浓度的乙醇洗脱，每1 BV收集洗脱液，HPLC测试，计算EGCG和ECG的得率。

1.5 脱色纯化

粗制EGCG单体需进一步脱色提高纯度，选取一脱色树脂进脱色后过柱液45℃真空浓缩，冷冻干燥。准确称取经脱色后的EGCG单体粗品4 g，用40℃温水溶解，配制成浓度为40%的溶液，保存于10 ml试管中，放入4℃冰箱中析晶，24 h后0℃，2000 r/min低温离心20 min，过滤，用4℃蒸馏水反复冲洗晶体，低温真空干燥，HPLC测定EGCG纯度。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂的筛选

吸附树脂由于其极性、孔隙度、孔径、表面积和是否能形成氢键等物理化学性质不同，对不同物质的吸附和选择性也不相同[26-27]。实验选择了4种不同性质的树脂进行分离比较，不同树脂对酯型儿茶素脱除ECG实验结果见表2。

由表2可知4种树脂吸附饱和后，低浓度乙醇均可将EGCG洗脱下来，其中AB-8树脂在10%乙醇洗脱液中未检测到ECG，而其他3种都有ECG出现，说明AB-8在10%乙醇洗脱条件下对分离酯型儿茶素中EGCG和ECG有较好的效果。

极性大的化合物一般适于中极性树脂分离，而极性小的化合物适于非极性树脂分离。其中儿茶素是弱极性物质，AB-8作为一款非极性树脂，符合这一要求。同时，需分离物的分子体积大小也是选择树脂型号的主要因素之一，分子体积较大的化合物应选择较大孔径的树脂。可能由于AB-8的孔径、比表面积等因素恰好符合分离EGCG和ECG的要求，因此实验选择AB-8作为纯化EGCG的目的树脂。

洗脱剂的选择也至关重要，随着乙醇浓度的增加，洗脱剂的极性不断减小。对于非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强，对于中极性和极性大孔树脂则洗脱剂极性越大，洗脱能力越强。10%低浓度的乙醇极性较大，洗脱非极性树脂AB-8，其洗脱能力较弱。实验用10%乙醇洗脱能将EGCG和ECG分离，表明在洗脱剂极性较大的情况下ECG仍吸附牢固不被洗脱，而EGCG与树脂之间的作用力已遭到破坏，容易被洗脱，故实验选择10%乙醇作为洗脱剂较为合适。

2.2 AB-8动态吸附流速和洗脱流速的优化

2.2.1 吸附流速对树脂吸附EGCG吸附量的影响

3种吸附流速条件下EGCG的吸附穿透曲线见图1。当酯型儿茶素水溶液以1 BV/h的流速流经50 g（约90 ml）AB-8湿树脂的树脂床后，在流出液5 BV时EGCG出现泄漏，可认为此时树脂已吸附饱和，最大吸附量为21.7 mg/g。当流速为2 BV/h时，EGCG在4 BV出现泄漏，当流速为3 BV/h时，EGCG在3 BV出现泄漏。两个流速的泄漏点均比1 BV/h时提前。主要因为流速影响溶质向树脂表面的扩散速度，流速太快，溶质分子来不及扩散到树脂表面而发生穿透现象，因此实验结果表明1 BV/h时吸附效果最好。

2.2.2 洗脱流速对洗脱EGCG效率的影响

按上述饱和吸附量及吸附流速上样，饱和后用水洗至流出液颜色近无色或颜色不再变淡时，用10%乙醇分别以1 BV/h，2 BV/h，3 BV/h流速洗脱，每1 BV分段收集，HPLC分析每段EGCG浓度。结果如下图2可知，当流速为1 BV/h时，由于洗脱流速过小，出现拖尾现象。当增大流速时，树脂颗粒表面液膜变薄，液膜阻力减小，造成液膜传质系数增大，传质速率增加。在3 BV/h流速下，单位时间内EGCG的洗脱速率最大，但单位体积内EGCG的洗脱量小于2 BV/h时的洗脱量，综合考虑选择2 BV/h的洗脱流速。当2 BV/h流速时，单位体积内EGCG的浓度最大，EGCG得率最高，洗脱体积控制在4～5BV即可。

图 1 不同吸附流速下酯型儿茶素穿透曲线Fig.1 Breakthrough curve of ester catechins under different adsorption velocities注：C0：上样液酯型儿茶素浓度；C：流出液酯型儿茶素浓度。

图 2 不同洗脱体积中EGCG含量 Fig.2 Contents of EGCG in different elution volumes

2.3 AB-8树脂中试

按最佳工艺参数上样，10%乙醇和20%乙醇分别洗脱4 BV，分段收集洗脱液，结果如下表3。由表可知10%洗脱4个BV即可将大部分EGCG洗脱，且EGCG得率在90%以上。而20%可大量洗脱ECG，得率在50%左右，此段洗脱液可得到纯度较高的ECG单体作为EGCG的副产品。

将洗脱液直接经脱色树脂ADS-7脱色，直至过柱液出现颜色即可认为色素已渗漏，停止过柱，过柱液浓缩，冷冻干燥，得到乳白色纯度约92.65%的EGCG单体样品，50.91%的ECG单体样品。

2.4 EGCG粗品结晶纯化

结晶即溶质从溶液中析出的过程，其推动力是在一定条件下溶质的浓度超过该溶质的溶解度，形成过饱和溶液。EGCG在水中的溶解度比较大，因此结晶时溶质需选择合适的浓度，浓度过高，溶解困难，需热水和超声溶解，实验操作繁琐，且EGCG极不稳定，溶解时温度过高易使EGCG发生氧化，影响实验结果。实验时选择将中试所得的粗EGCG样品配制成40%浓度的溶液，4℃，析晶24 h，离心20 min（0℃，2000 r/mim），除去上清液，将晶体低温真空干燥，得到白色细颗粒状EGCG单体，纯度达98%，图3为产品的液相色谱图。

3 结论

将EGCG纯度为54.41%的酯型儿茶素，经过AB-8大孔吸附树脂吸附洗脱，流经脱色树脂脱色，最后通过结晶纯化，最终得到纯度达98%的EGCG单体。该过程只需用到乙醇这一无毒的有机溶剂，且10%浓度的乙醇成本低，效果好，因此所得产品绿色环保，应用领域相对广泛。

根据“类似物易吸附类似物”的原则，即一般非极性大孔树脂适用于从极性溶液（如水）中吸附非极性有机物；而极性大孔树脂适用于从非极性溶液中吸附极性溶液；中等极性吸附剂，不但能够从非水介质中吸附极性物质，同时他们具有一定的疏水性，也能从极性溶液中吸附非极性物质[28]。AB-8作为一种非极性大孔树脂，能够从极性溶液水中吸附弱极性的儿茶素，而且效果好，EGCG吸附量21.7mg/g（树脂含水量60%），较同类型树脂大[29]，并且在低浓度乙醇洗脱下EGCG和ECG得以有效地分离，得率达到93.38%。

茶叶中的色素分为水溶性色素和脂溶性色素，实验中所遇到的色素均为水溶性色素，主要是由儿茶素等多酚类物质氧化聚合后的产物组成，包括茶黄素，茶红素等[30]，对EGCG产品外观纯度影响很大。茶色素结构复杂、分子差异大，在实验过程中难以被除尽，又极容易形成，因此对色素形成的机理、形成条件的控制以及脱色的有效方法有待后续进一步探索研究。

图 3 结晶纯化后的EGCG液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of EGCG after crystallization

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A New Technology for the Purification of EGCG

HUANG Lei1，YANG Jun-guo2，FU Jie1，XIA Xiao-huan1，QIU Jun-lin1，CHEN Xu-dong1

（1.Shaoxing Institute of Agriculture Sciences，Shaoxing，Zhejiang 312003，China2.Tea Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fu'an，Fujian 355015，China）

The way to isolate (-)-epigallocatechin gallate（EGCG）from crude ester catechins with macroporous adsorptive resins in combination with crystallization was investigated in this paper. After comparing the adsorption and desorption capacities among four macroporous adsorptive resins, the optimal resin was chosen, which were further investigated via evaluating the characteristics of gradient elution with ethanol, and finally monomer EGCG was separated by crystallization. The results showed that macroporous adsorptive resins AB-8 possessed the best adsorption selectivity for EGCG. After eluted by 10% ethanol, the purity of EGCG was enhanced from 54.41% to 92.65%, and the yield reached 93.38%. By crystallization, the purity of monomer EGCG was beyond 98%.

EGCG, macroporous adsorptive resin, crystallization, purification

黄磊（1986-），男，硕士研究生，助理农艺师，主要从事茶叶深加工、茶树栽培。Email: huangleiscott@163.com；