猪源沙门菌耐药机制及耐药性研究进展

陈 龙，张春霞，康元环，单晓枫＊，曹 亮，王娇娇，钱爱东＊

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林省华政动物保健品有限公司，吉林长春130114）

沙门菌（Salmonella）属于肠杆菌科革兰阴性杆菌。其动物宿主广泛，可以引发人和动物胃肠炎、败血症、其他中毒性感染等疾病。猪源沙门菌一直是危害养猪业发展和动物性食品卫生的重要人畜共患病病原之一。近年来，随着抗菌药物在农业、畜牧业、临床治疗中的广泛使用，特别作为抗菌生长促进剂使用时以次治疗剂量添加到饲料中，使猪源沙门菌耐药株不断产生，尤其是强毒株普遍出现了多重耐药现象，给公共卫生带来巨大隐患。猪源沙门菌目前在我国兽医临床较为常见，而其猪源沙门菌耐药性的耐药机制资料及耐药性调查的统计数据还相对缺乏。因此，本文就猪源沙门菌的耐药机制及中、美两国近10年耐药性调查做一综述，期望对促进我国养猪业的健康发展和公共卫生提供参考。

1 猪源沙门菌的耐药机制

沙门菌的耐药机制复杂多样，沙门菌耐药水平的提高已经成为全球关注的焦点。根据目前研究人员报道，沙门菌耐药的主要耐药机制大致可分为以下几类：①细菌产生灭活酶使药物失活；②改变细菌细胞膜对抗菌药物的通透性；③激活外排泵排除抗菌药物和作用靶位结构的改变等。猪源沙门菌针对不同类抗菌药物分别利用一种或多种耐药机制介导，从而产生耐药性。

1.1 β-内酰胺类

沙门菌中大多数能抵抗青霉素和头孢菌素归因于能够产生β-内酰胺酶，这类酶能使β-内酰胺类抗菌药物开环灭活。目前，通过调查研究，已发现700多种β-内酰胺酶。其中，超广谱β-内酰胺类酶（ESBLs）能够降解多种抗菌药物，属Ambler分类中的A类，按Bush分类属2be群。广谱β-内酰胺酶根据基因来源和进化关系在沙门菌中可分为TEM型，SHV 型、CTX-M 型、OXA 型［1］。张 文 波 等［2］研 究发现如果临床分离的猪源沙门菌具有超广谱β-内酰胺类酶，其对第3代和第4代头孢菌素类和青霉烯的耐药率高于普通沙门菌株。Arlet等发现临床上分离得到的具有CTX-M型酶的猪源沙门菌抗头孢噻肟的水平非常高。此外，Aarestrup等还通过氨基酸序列的相似性分析把其中CTX-M型β-内酰胺酶分为5组，即CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTXM-9和CTX-M-25，并发现编码CTX-M型酶的基因主要存在于猪源沙门菌的质粒上。

1.2 喹诺酮类

喹诺酮类或氟喹诺酮类药物主要作用细菌DNA螺旋酶（gyrA和gyrB）和拓扑异构酶Ⅳ（parC和parE）。抗菌药物靶标基因突变直接导致细菌耐药。此外，沙门菌还可通过AcrAB-TolC外排系统排除药物降低药物浓度［3］。

沙门菌中耐喹诺酮类药物起初是由于gyrA基因上的点突变，gyrA基因负责编码螺旋酶的A亚单位，是喹诺酮类药物的最初靶位。gyrA蛋白第67（Ala）和106（Gln）位氨基酸残基之间被称为喹诺酮耐药决定区（Quinolone resistance determining region，QRDR）。氨基酸在喹诺酮耐药决定区83位点上发生突变，即色氨酸变成苯丙氨酸或酪氨酸，或者在87位点的天冬氨酸变成甘氨酸或天冬酰胺、酪氨酸，这些是猪源沙门菌株中抗萘啶酸最常发生的点突变。此外，猪源沙门菌gyrB基因突变，同样可导致喹诺酮耐药。Olsen等研究发现猪霍乱沙门菌一旦parC基因发生突变，直接导致氟喹诺酮类药物抑菌水平下降16倍～32倍。目前，统计数据显示猪源沙门菌靶基因突变有以下几种情况，即gryA基因上2个不同的双突变、gyrB基因上发生单突变、parC基因上3种不同的单突变和首次在parE基因上发生单突变等。因此，药物作用靶位的突变造成沙门菌对喹诺酮类药物的耐药性。

1.3 氨基糖苷类

氨基糖苷类抗菌药物的耐药性与沙门菌修饰的钝化酶有关。相关酶主要有3类，分别为磷酸转移酶、乙酰转移酶、腺苷转移酶。其中，乙酰转移酶可以将氨基酸乙酰化，腺苷转移酶和磷酸转移酶可分别将羟基（-OH）腺化和磷酸化，从而使氨基糖苷类抗菌药物灭活，产生抗性［4］。

D Costa V M 等［5］和 Haley C A 等［6］阐述了部分猪源沙门菌耐药基因与耐药性的关系如下：氨基糖苷磷酸转移酶类由耐药基因aphA编码，负责卡那霉素抗性；氨基糖苷类乙酰转移酶由耐药基因aacC编码，可导致庆大霉素耐药；氨基糖苷类腺苷转移酶类由耐药基因aadA和aadB编码，负责链霉素和庆大霉素耐药。此外，还有很多研究人员分别在抗氨基糖苷类抗菌药物猪源沙门菌中检测出了aacC、aphA、aadA 和aadB 等耐药基 因［7-8］，说 明 猪源沙门菌氨基糖苷类抗菌药物的抗性与这些耐药基因密切相关。

1.4 其他类抗菌药物

猪源沙门菌耐四环素和氯霉素主要由外排泵所介导，使得细菌细胞膜的外排能力增强，从而将细胞内的药物排出。猪源沙门菌中，大多数耐四环素的外排系统是由耐药基因tet编码的。研究发现，2009年-2010年贵州省猪源沙门菌四环素耐药率高达96%，通过对高耐药分离菌进行PCR扩增耐药基因，结果受测菌株均扩增出耐药基因tet［9］。而耐氯霉素的外排系统则由耐药基因floR或cml负责编码。

甲氧苄氨嘧啶和磺胺类药物主要抑制细菌叶酸的生物合成。沙门菌中耐磺胺类药物的频繁出现与耐药基因sulⅠ或sulⅡ的获得有关，这个基因改变了二氢喋呤合成酶，降低了磺胺类药物在叶酸生物合成中的抑菌作用。同样，研究发现猪源沙门菌中耐甲氧苄氨嘧啶的现象与耐药基因dhfr密切相关，这个基因改变了二氢叶酸还原酶，使其与抗菌药物的亲和力减少，即便有甲氧苄氨嘧啶存在的情况下，细菌叶酸仍能生物合成，抑菌作用大大降低。

2 中、美两国猪源沙门菌耐药性调查

自从抗菌药物被发现以来，在治疗、控制和预防动物疾病等方面起到巨大作用，但抗菌药物滥用是导致猪沙门菌耐药性产生的直接原因。发达国家很早就使用抗菌药物作为饲料添加剂，但对其危害的认识早，从政府、消费者到生产者都给予了高度关注，抗菌药物在饲料添加剂中的使用在不断减少。我国对于抗菌药物作为饲料添加剂也在法律法规中明确禁止，但由于抗菌药物滥用造成的细菌耐药性则远远超过美国，致使常规抗菌药物治疗效果下降，给公共卫生健康带来巨大的隐患。鉴于耐药性猪源沙门菌在公共卫生领域的重要意义，我国和美国都开展了对其耐药性的监测研究方面的工作。

2.1 美国对猪源沙门菌的耐药性调查研究

在美国，每年都有猪源性沙门菌感染事件发生，引发人们食物中毒和胃肠炎，是主要的公共健康问题。美国很早就开展了食品动物源细菌的耐药性监测工作，并建立实施一系列法律法规全面限制或禁止抗菌药物在动物中的使用。通过国家耐抗菌药物检测系统（National antimicrobial resistance monitoring system，NARMS）对1997年-2007年美国猪源沙门菌耐药性监测分析发现，2007年猪中非伤寒沙门菌的分离率为43.1%，并且所有菌株至少抗一种抗菌药物。这与1996年的报道相近，说明耐药率呈稳定趋势，猪源沙门菌耐药得到了控制，但许多猪源沙门菌相继出现了多重耐药性。

目前，在美国最常见的猪源沙门菌多重耐药（MDR）表型是ACSSuT，即氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺甲恶唑/磺胺异恶唑和四环素。其中鼠伤寒沙门菌DT104是耐ACSSuT表型最常见的菌株［10］。根据食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）统计报道，从表1中可见，1997年-2007年，耐药表型为ACSSuT的猪源多重耐药沙门 菌 分 离 率 分 别 为 20%、54.3%、46.5%、39.5%、45.5%、47.9%、44.4%、60.4%、50%、44%及47.4%，表明鼠伤寒沙门菌多重耐药现象比较普遍，并且逐渐出现了高水平耐氟喹诺酮类和头孢菌素的鼠伤寒沙门菌［11］。Gebreyes等研究报道了1997年-2000年美国北卡罗莱纳州24个规模化猪场中猪源沙门菌对多种药物不同程度的耐药水平，其中大部分对环丙沙星、头孢噻肟、丁胺卡那霉素都比较敏感，鼠伤寒沙门菌中氯霉素、头孢噻吩、庆大霉素、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑的耐药率较低，分别为5%、2%、2%及1%，然而鼠伤寒沙门菌突变株Copenhagen中环丙沙星、头孢噻肟、丁胺卡那霉素的耐药率均为78%［12］。

其他血清型沙门菌在美国分离率较低，且耐药性情况较轻，猪感染肠炎沙门菌的病例比较罕见，分离到的猪源沙门菌中都没有检测出耐药性；猪霍乱沙门菌的病例报告很少，在过去的10年里，每年大约平均发生40例；猪源海德堡沙门菌只在2000年分离出耐药模式为ACSSuTAuCf（氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺甲恶唑/磺胺异恶唑和四环素、阿莫西林-克拉维酸与头孢噻呋）的菌株，且分离率仅为4.5%；猪源纽波特沙门菌只在2001年和2003年被分离出来，且耐药模式为ACSSuTAuCf的菌株分离率分别为85.7%和100%，此次沙门菌的暴发可能与进口畜禽食品有关，其他年份均没有耐药性猪源沙门菌的报道［13］（表1）。

表1 1997年-2007年美国食品动物中分离到耐药模式为ACSSuTa的猪源沙门菌Table 1 Resistance patterns（ACSSuTa）among Salmonella isolates from swine in USA from year 1997-2007

因此，在美国猪源沙门菌中除鼠伤寒沙门菌仍分离率较高且呈多重耐药性外，其他血清型致病性猪源沙门菌分离率均较低。所以，美国整体猪源沙门菌耐药性呈稳定下降趋势。

2.2 中国猪源沙门菌耐药性的调查研究

在中国，由于大多数养殖者为追求效益和生产性能等指标曾长期过量使用抗菌药物，忽视了抗菌药物滥用会造成较严重的强化细菌耐药性，甚至出现严重的多重耐药现象。近些年来，政府通过在法律法规上重新规定和耐药性监测分析，使得猪源沙门菌耐药现象得到了广泛关注。

从表2可见，笔者通过对我国近10年部分中部及南部省份猪源沙门菌ACSSuT耐药率进行统计发现，猪源沙门菌在各个省份耐药现象十分普遍，且耐药率普遍高于50%；其中，四川省猪源沙门菌四环素耐药率最高可达98.36%，其他省份耐药率也在90%左右，这可能与四环素类抗菌药物具有价格低、作用范围广和毒性小等优点，在畜禽养殖业中长期广泛使用有关；猪源沙门菌链霉素耐药率在各省份之间存在差异，广西省和贵州省耐药率较低，四川和湖北省耐药率均高于80%，这可能与区域用药有关；虽然我国早在2002年明确规定禁止氯霉素在畜牧业中使用，但各省份猪源沙门菌氯霉素的耐药率仍然较高（约80%）的现象表明氯霉素的使用引致细菌耐药性的产生依然延存，这可能与猪源鼠伤寒沙门菌具有ACSSuT的耐药基因密切相关；耐氨苄青霉素和磺胺类药的猪源沙门菌几乎在各个省份都能分离得到，这可能与很多疾病都是在未能确诊的情况下就首选青霉素类和磺胺类药物以及与饲料中抗菌药物的添加及添加量密切相关。由上述可见，中国部分地区近10年间猪源沙门菌耐药情况十分严重，不容忽视。

此外，笔者还对我国9大省份近10年来猪源沙门菌多重耐药率进行了汇总（表3）。从表3可见，安微省、广西省、四川省、湖北省、山东省、陕西省中几乎100%都是多重耐药菌株，说明多重耐药现象十分普遍；广西、贵州、湖北、山东等省猪源沙门菌呈现较高的多重耐药性，耐10重以上抗菌药物的菌株检出率较高，最高为湖北省可达82.9%，究其原因，在检测山东省7个不同地区规模化猪场95株猪源多重沙门菌耐药性时发现，其呈现较高的多重耐药性是与动物饲养过程中抗菌药物的不规范使用或滥用密切相关［23］；分析湖北省903个临床发病猪分离得到41株猪源沙门菌，这些多重耐药菌株可能与生猪买卖流动，造成多重耐药菌株的传播有关［17］；而广西自治区11个规模化猪场分离得到21株猪源沙门菌表现出的100%耐6重～9重抗菌药物，蹇慧等［21］认为这可能与噬菌体型DT104沙门菌的在广西自治区流行有一定关联；李基棕等［9］分析贵州省3个地（州市）6个规模猪场25株猪源沙门菌分离株的多重耐药现象，可能原因是与耐药质粒在细菌间传递以及当地气候环境等因素密切相关。虽然我国尚未在全国范围内进行猪源沙门菌的耐药性普查，但由上述数据可以推断出，我国猪源沙门菌多重耐药现象已经十分严重。

表2 近10年我国部分省份猪源沙门菌ACSSuTa耐药率统计表Table 2 The rates of ACSSuTaresistance from swine Salmonellain parts of China in recent 10years

表3 近10年我国部分省份猪源沙门菌多重耐药率统计表Table 3 The rates of multi-drug resistance from swine Salmonellain parts of China in recent 10years

2.3 中、美两国猪源沙门菌耐药性调查研究对比

通过对中、美两国近10年来猪源沙门菌耐药性相关文献进行归纳总结发现，猪源沙门菌在中、美两国耐药情况普遍，多重耐药现象严重。美国猪源沙门菌耐药性较我国耐药情况要轻，除鼠伤寒沙门菌仍分离率较高外，其他血清型分离率较低，这与美国对猪源沙门菌耐药性长期以来的重视有密切关系。其中，鼠伤寒沙门菌是造成美国沙门菌感染的主要血清型，但其呈全球化扩散，已经在欧美、亚非等世界各地广泛传播，多种耐药现象普遍。而中国猪源沙门菌耐药率及多重耐药现象十分严重，不仅能够分离出鼠伤寒沙门菌，德尔卑沙门菌、猪霍乱沙门菌以及肠炎沙门菌等多个血清型在临床上也能常常分离得到，且耐药情况呈严重多重耐药现象。虽然相关法律法规已经相继出台，但由于长期抗菌药物的滥用，猪源沙门菌严重耐药情况的整治需要时间。

3 结语

猪源沙门菌作为一种人畜共患病病原菌，在国外，很多国家通过采用新的耐药性监测立法来控制其严重耐药率和多重耐药现象［25］。主要畜禽生产国家已经建立了本国监测系统，即美国肠道细菌耐药性检测系统、欧洲耐药性监测系统、日本兽医细菌耐药监测系统等。中国猪源沙门菌的高携带率及复杂的耐药表型已经成为动物源性食品卫生关注的焦点，我国农业部在2008年启动了动物源细菌耐药性监测计划，迄今已经监测了6年。为了确保抗菌药物在畜牧兽医中的谨慎使用，我们需要提高监控新兴药物抗菌性的问题、延长抗菌药物的使用寿命、合理使用抗菌药物。同时，改进诊断和感染控制等措施。本实验室也对吉林省部分大型规模化猪场及中小型养殖户进行猪源沙门菌分离鉴定及耐药性分析，希望能为猪源沙门菌流行传播的预防监测和耐药性防控提供参考。

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