膜荚黄芪内生真菌的分离与鉴定1)

龚 贺 张雷鸣 任伟超 张艳贺 刘秀波

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

孔祥军 佟春香 马 伟

(齐齐哈尔医学院第一附属医院) (齐齐哈尔中医医院) (黑龙江中医药大学)

植物内生菌是指生活在健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，是与宿主植物在长期共同进化过程中衍生的一类微生物［1］。据内生菌与宿主植物的亲和关系，可将其分为专一性和非专一性。内生菌在寄主的科、种以及组织水平上都存在专一性［2－3］。而某些植物内生菌自身或其次生代谢产物中含有和宿主植物相同或相近的活性成分［4－6］，在一定程度上为解决临床药物来源以及农作物的生物防治等方面提供了新的思路［7］。药用植物内生真菌的研究虽然处于起步阶段，但其实用价值和社会价值已经受到越来越多的重视，从药用植物内生真菌次生代谢产物中筛选有效的活性物质或新型化合物以研究新的药物，将在很大程度上丰富人类医药宝库，解决自然资源不足，实现可持续发展［8－9］。

1 研究方法

1.1 分离纯化培养基

PDA(A):PDA 粉末与蒸馏水配制而成。牛肉膏蛋白胨固体培养基(B):牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、水lL、pH =7.4 ～7.6。LB 固体培养基(C):胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、琼脂20 g。高氏I 号培养基(D):可溶性淀粉20.00 g、KNO31.00 g、NaCl 0.50 g、K2HPO40.50 g、MgSO40.50 g、FeSO40.01 g、蒸馏水1 L、琼脂20.00 g、pH=7.4 ～7.6。孟加拉红培养基:蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20.0 g、1/3 000 孟加拉红溶液0.1 L、氯霉素0.1 g、蒸馏水1 L。

1.2 液体发酵培养基

马铃薯葡萄糖液体发酵培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH 自然条件。

1.3 内生真菌的分离

采用组织分离法，植物材料取自哈尔滨呼兰区7月份膜荚黄芪2年生植株。选择无病斑的新鲜的黄芪根、叶部分，用无菌水冲洗干净，用解剖刀把根切成3 cm 的小段保持切口整齐，叶片切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的方块型小片，在干净滤纸上吸干水晾干。在无菌条件下，将切好的材料用自来水冲洗干净，75%的乙醇漂洗5 min，无菌水冲洗3 次(每次2 min)。将处理过的根段和叶在无菌条件下切去两端，根切成小片，随即将小片分别种植于PDA、LB、高氏、牛肉膏培养基平板上，每种培养基设3 个平行皿，每皿4 片，置于培养箱中28 ℃倒置培养3 ～7 d。

叶片处理同根处理。空白对照做3 种处理:一是空白培养基不接组织块;二是将培养基内接入消毒时要使用的同等条件下灭菌的无菌水少许;三是在消毒的操作过程中，将培养基的培养皿开放暴露于超净台内。验证培养基、无菌水和超净台灭菌是否彻底。观察各组织块在4 种培养基上的生长状态，采用无菌接种针在组织块周围将刚长出的菌丝边缘部分移接到新鲜培养基上划线，随时观察培养基变化，挑少许菌丝到平板上和其他3 种培养基上反复进行经典过程纯化。

为检查材料表面消毒是否彻底做如下对照试验:直接接组织块，将与上述同样处理过的根段和叶不做分割，直接种植在4 种培养基平皿上;在相同条件下培养，接洗涤水，将最后一次清洗消毒组织块的无菌水涂于4 种培养基表面，置于同等条件下培养;将与上述同样处理过的根段和叶直接在4 种培养基表面做印记。

随时观察试验培养皿及对照皿出菌情况及组织片变化，待根组织边缘和叶边缘长出菌后，挑取菌丝或菌体，经平板划线法反复分离、纯化，培养观察菌落的形态，比较4 种培养基对黄芪内生真菌的分离情况，并转入相应斜面培养基培养16 h，放入冰箱中4 ℃短期保藏，备用。

1.4 表面消毒的效果检测

1.4.1 无菌水检验法

将表面消毒的样本在灭过菌的5 mL 无菌水中震荡，取出样本，取1 mL 菌悬液涂布在PDA 培养基表面，25 ℃下恒温培养1 周，观察记录是否有真菌长出。

1.4.2 组织块印迹法

植物样本经过上述表面消毒流程后，叶片选取整片叶片、根选2 cm 的小段，直接接到PDA 固体培养基上，25 ℃下恒温培养1 周，观察记录是否有真菌生长。再经过改进，上述流程下灭过菌的组织块在PDA 培养基上轻轻印记，再取出组织块，将培养基在25 ℃下恒温培养1 周，并观察是否有菌落产生。

1.5 内生真菌的形态鉴定

根据根叶在4 种培养基上的生长状况，显微镜观测记录，菌株形态参考《真菌鉴定手册》。制成水载片，用光学显微镜定期观察产孢内生真菌菌丝结构、菌落形态特征等指标鉴定到属。

手工挑取真菌单孢子显微操作:选用2 台普通生物显微镜，2 支自制玻璃挑孢针。每次挑取不同内生真菌时需重新使用洁净的挑孢针，在超净工作台上操作。取出待分离的平板培养皿真菌材料，在显微镜的物镜下找到平板中菌落边缘分散的孢子，将针尖轻轻向视野中间的菌落边缘单个孢子靠碰，有时一次碰孢子即可粘附到针尖上，更多情形时经过多次靠碰，才能粘附到针尖上。当视野中要碰取的单个孢子消失了，说明已沾到针尖上，此时轻轻抬起针头，并移离显微镜下，将孢子转移到水载玻片上，加盖盖玻片，将载玻片移到显微镜观察孢子的形态进行鉴定。

2 结果与分析

从膜荚黄芪根、叶各培养基上共分离得到65 株内生真菌，结合菌落形态和显微结构特征，最终将膜荚黄芪内生真菌做出了明确的分类。在PDA 培养基上分离得到根中内生真菌55 株(37 株镰孢属，10株曲霉属、8 株青霉属)。在LB 培养基上得到3 株镰孢属根部内生真菌。在高氏培养基上得到1 株镰孢属根内生真菌。在PDA 培养基上得到6 株镰孢属叶片内生真菌。瘤坐孢科镰孢属(Fusarium)47株，菌丝在培养基中扩展呈棉絮状，常带有粉红色、紫红色，菌株菌丝为纯白色绒毛状表面部分突起，菌丝向外生长，纹饰疏松，边缘整齐，质地绒毛状、粉粒状、棉絮状，分泌色素有紫褐色、紫红色、或无色素。大型孢子多细胞，镰刀形，微弯或两端尖而小型分生孢子单胞，卵圆形或长圆形，单个孢子有3 个细胞，长圆形或略微弯。从梗孢科青霉属(Penicillium)10株，菌落绿色、黄绿色、青绿色或淡灰黄色纹饰致密，边缘整齐、革质状质地无渗出物。分生孢子梗从菌丝上单个的发生或不常成束，在顶部附近分支，对称或不对称，顶层为小梗，由小梗再生成分生孢子，单个孢子球形、卵圆形。从梗孢科曲霉属(Aspergillus)8 株，菌落由黄色再变成黄绿色，平坦或放射状沟纹，反面无色或带褐色质地絮状无渗出物纹饰致密。在幼小而获利旺盛时，菌丝体产生大量的分生孢子梗，分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形。顶囊表面长满1 层或2 层辐射状小梗。最上层小梗瓶状，顶端着生成串的球形分生孢子。孢子多呈绿、黄、褐色。分生孢子梗顶端膨大，分生孢子成串。孢子梗大部无横隔，光滑、粗糙或有痣点，常在顶部膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊。空白培养基、接灭菌水的培养基、印迹法周围均未有真菌产生，而消毒后切去两端的组织块周围在第5 天有白色菌落长出，此内生真菌明显从组织内部溢出(图1)。

图1 青霉属、曲霉属、镰孢属及其分生孢子

3 结论与讨论

对照平板培养约5 d 均没有观察到菌落长出，表明表面消毒彻底。从黄芪根、叶片中分离得到的内生菌共65 株，经显微形态观察、鉴定为半知菌门镰孢属、曲霉属、青霉属，其中镰孢属为优势菌群，且大都无孢子产生。

黄芪内生真菌培养到第5 天，菌落直径大多可达到9 cm，培养至第8 天时植物内生菌的菌落在PDA上明显比在牛肉膏、高氏、LB 培养基上菌落大且菌落生长良好。因此，将PDA 培养基作为植物内生真菌固体形态观察培养可行，观察效果良好。不同部位内生真菌差异有待研究，优势种群主要集中在根中分离得到的内生真菌，大多为镰孢属内生真菌。

挑孢针的制作及优点:2 支玻璃细管在酒精灯上烧红尖端部，加热后的玻璃细管前端融化部位接触粘连后迅速抽拉，拉直并拉成细针尖状，即得到所需的挑孢针。分离得到单孢子可靠，单孢子分离效率高，实用性好，可分离各种基质上的孢子，可分离不同种类和大小的孢子，可进行特殊需要的操作，比如分离单个孢子囊内的孢子，脱除孢子表面的细菌，工具简单，可在一般实验环境下进行，用少量的材料即可实施单孢分离。大多数分离出的内生真菌孢子大于5 μm 在10 倍物镜下清楚可见，可以方便地进行单孢子分离。其中一些内生真菌的孢子微小且颜色较浅时，一般需要40 倍物镜才能清楚检视，对于不产孢的菌株，通过适当光照或用挑孢针在菌落表面反复刮擦刺激产孢。

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