傣药止血藤化学成分的研究

龙 丽，邱晓燕，胡 琳，何耀莹，戴 云

(1. 云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室, 云南 昆明 650500； 2. 云南省标准化研究院，云南 昆明 650228；3.昆明振华制药厂有限公司，云南 昆明 650034)

密花豆属(SpatholobusHassk)植物是木质攀援藤本植物蝶形花科下的一个属，全世界约有40种,主要分布于热带地区.我国有该属植物10种和1变种,其主要分布在云南省.目前在临床上广泛使用的中药鸡血藤为密花豆属植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤茎，有活血化瘀、通络活筋的功效，常用来治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症[1].止血藤是一种傣族传统民族药, 特产于西双版纳勐养,是密花豆属单耳密花豆(S.uniaurit-usWei)种的干燥藤茎,在民间常被作为鸡血藤使用.傣语称之为“嘿亮浪”,其性辛、微甘,平,归肝、肾经，有补水补血、活血止血、除风止痛的功效[2].止血藤与正品鸡血藤同属密花豆属，至今未见对其化学成分研究的报道.为进一步开发利用该种植物，本论文对止血藤的化学成分进行了研究,分离得到8个化合物，分别鉴定为β-谷甾醇(β-sitosterol) (1)、豆甾醇(stiqmssterol) (2)、豆甾-4-烯-3-酮(stigmast-4-en-3-one)(3)、3-羟基-豆甾-5-烯-7-酮(3-hydroxystigmast-5-en-7-one)(4)、白桦脂酸(betulinic acid)(5)、大黄素(Emodin)(6)、大黄素甲醚(Physcion)(7)、羽扇豆酮(Lupeone)(8).所有化合物均为首次从该植物中分离得到.

1 实验部分

1.1 仪器与材料

YRT-3型熔点测定仪(温度未校正); Bruker DRX-500型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司生产),TMS为内标; VGZAB-ZF 质谱仪;高效制备液相色谱仪(LC 3000型);GL-21M高速冷冻离心机(湘仪实验室仪器有限公司).

柱色谱硅胶(200～300目)和 GF254高效薄层色谱板均为青岛海洋化工厂生产;Pharmadex LH-20(安玛西亚生物技术公司生产);大孔吸附树脂D101(40～60目)为沧州宝恩吸附材料有限公司生产;反相RP-18材料,提取溶剂为工业乙醇,其余试剂为分析纯.

1.2 样品的来源

止血藤茎采自云南西双版纳勐养,经云南民族大学胡琳副教授鉴定为止血藤,标本保存于云南民族大学化学与生物技术学院标本室.

1.3 样品的提取与分离

将干燥的止血藤粗粉9 kg,经粉碎后用95%乙醇冷浸提取2次,每次48 L,每次7天,然后将药渣压榨,再将浸出液和榨出液合并,减压浓缩,得红色浸膏1.5 kg,在浸膏中加入适量水使其溶解,用高速冷冻离心机离心,得到不溶物和上清液两部分.不溶物分别用氯仿与甲醇溶解，得到氯仿溶解部分和甲醇溶解部分.上清液上大孔树脂依次用30%乙醇、45%乙醇和95%的乙醇、丙酮进行梯度洗脱,分别得到浸膏576、256、27.6、2.0 g.

氯仿溶解部分用硅胶柱色谱分离,用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=(1∶0～0∶1)梯度冲洗,得到6个组分(Fr.1～Fr.6).组分Fr.3～Fr.5反复经硅胶柱层析,用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=(60∶1～0∶1)为洗脱剂,经Pharmadex LH-20凝胶柱色谱,重结晶等方法,得到化合物1,2,5.组分Fr.6经硅胶柱层析,以V(氯仿)∶V(甲醇)=(30∶1～0∶1)为洗脱剂反复进行硅胶、Pharmadex LH-20凝胶柱色谱V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1,分别得到化合物4和3.

上清液中30%乙醇部分：取上清液部分,经大孔吸附树脂D101(40～60目),用V(水)∶V(乙醇)=(1∶0～0∶1)进行梯度洗脱,最后用丙酮冲洗.得到5个部分.组分Fr.2经聚酰胺柱层析,以V(水)∶V(甲醇)=(1∶0～0∶1)为洗脱剂进行梯度洗脱,得到3个组分,组分Fr.2.1经过Pharmadex LH-20柱,半制备液相得到化合物7.组分Fr.3经过反复半制备液相V(水)∶V(甲醇)=(1∶0～0∶1)为洗脱剂以及Pharmadex LH-20凝胶层析柱,得到化合物5,6.

2 化合物的结构鉴定

化合物1：白色针状晶体(氯仿),硫酸显色为紫红色;ESI-MS给出准分子离子m/z：414[M]+,m.p.139～141 ℃.结合谱图推测分子式为C29H50O.在1H NMR (500 MHz，CDCl3)低场区观察到一个烯氢质子信号5.34和一个连在氧C上的质子信号3.50(1H,m，H-3),结合C谱推测该化合物为甾醇类.它的1H NMR和13C NMR的数据与文献[3]报道的β-谷甾醇的数据基本一致，鉴定为β-谷甾醇.

化合物2：白色针状晶体(氯仿),硫酸显色为紫红色;m.p.162～164,ESI-MS给出准分子离子峰m/z：414[M+H]+.与β-谷甾醇比较,13C NMR谱中δC-22和δC-23分别向138.3和129.1的低场移动,推测在22和23位上形成了双键.该化合物的1H NMR和13C NMR数据与文献[4]报道的数据基本一致，鉴定为豆甾醇.

化合物3：白色晶体(氯仿),ESI-MSm/z:435 [M+Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.65(1H,s,H-4),1.19(3H,s,H-19),0.94(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.85(3H,t,J=6.5 Hz,H-29),0.80(3H,d,J=6.5 Hz,H-27),0.79(3H,d,J=6.5 Hz,H-26),0.65(3H,s,H-18),13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:35.6(C-1),33.9(C-2),199.7(C-3),123.6(C-4),171.8(C-5),32.9(C-6),31.9(C-7),35.5(C-8),53.7(C-9),38.5(C-10),20.9(C-11),39.5(C-12),42.3(C-13),55.8(C-14),24.1(C-15),28.3(C-16),55.9(C-17),11.9(C-18),17.3(C-19),36.0(C-20),18.6(C-21),33.9(C-22),26.1(C-23),45.7(C-24),29.1(C-25),19.7(C-26),18.9(C-27),22.9(C-28),11.9(C-29).以上数据与文献[5]报道的豆甾-4-烯-3-酮数据基本一致，鉴定为豆甾-4-烯-3-酮(stigmast-4-en-3-one).

化合物4：白色晶体(氯仿),ESI-MSm/z：451[M+Na]+；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ:5.69(1H,s,H-6),3.67(1H,m,H-3),1.19(3H,s,H-19),0.93(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.85(3H,d,J=6.5 Hz，H-27),0.82(3H,d,J=6.5 Hz,H-26),0.79(3H,t,J=6.6 Hz,H-29),0.69(3H,s,H-18).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:36.2(C-1),31.0(C-2),70.4(C-3),41.7(C-4),165.3(C-5),126.0(C-6),202.5(C-7),45.3(C-8),49.8(C-9),38.6(C-9),38.6(C-10),21.1(C-11),36.2(C-12),43.1(C-13),49.8(C-14),28.5(C-15),29.0(C-16),54.6(C-17),11.9(C-18),17.2(C-19),36.0(C-20),18.9(C-21),33.9(C-22),26.2(C-23),45.7(C-24),31.0(C-25),19.7(C-26),18.8(C-27),22.9(C-28),11.9(C-29).以上数据与文献[6]报道的3-羟基-豆甾-5-烯-7-酮数据基本一致，鉴定为3-羟基-豆甾-5-烯-7-酮(3-hydroxystigmast-5-en-7-one).

化合物5：白色针尖(氯仿), ESI-MSm/z：456[M]+；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:4.73,4.60(1H.s,29-CH2);3.17(1H,m,H-3),1.68,0.97,0.94,0.93,0.84,0.75(各3H,s,6xCH3).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:38.7(C-1),27.7(C-2),78.7(C-3),38.6(C-4),55.2(C-5),18.1(C-6),32.1(C-7),46.8(C-8),50.4(C-9),37.0(C-10),20.8(C-11),26.9(C-12),38.1(C-13),48.6(C-14),29.5(C-15),32.8(C-16),56.1(C-17),49.2(C-18),48.9(C-19),150.6(C-20),29.7(C-21),37.5(C-22),28.3(C-23),15.7(C-24),15.2(C-25),15.9(C-26),14.5(C-27),179.0(C-28),109.3(C-29),19.4 (C-30).以上数据与文献[7]报道的数据基本一致，鉴定为白桦脂酸(betulinic acid).

化合物6：橙黄色晶体(吡啶);EI-MSm/z：293[M+Na]+；1H NMR(500 MHz,DMSO)δ:12.09(1H,s),11.99(1H,s),11.36(1H，s), 7.43(1H,s),7.12(1H，s),7.07(1H,d,J=2.4 Hz)，6.56(1H，d，J=2.4 Hz),2.38(3H，s，CH3),13C NMR(126 MHz,DMSO)δ:190.1(C-9),181.5(C-10),166.4(C-3),164.5(C-1),161.6(C-8),149.2(C-6),135.4(C-10a),133.0(C-4a)、124.3(C-7),120.9(C-5),114.0(C-8a),109.6(C-9a),108.7(C-4),108.0(C-2),22.0(6-CH3).以上数据与文献[8]报道的数据基本一致，鉴定为大黄素(Emodin).

化合物7：黄色晶体(氯仿)，EI-MSm/z：284[M]+；1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:12.31(1H,s,OH-8),12.10(1H,s,OH-1),7.63(1H,s,H-4),7.36(1H,d,J=2.5 Hz，H-5),7.07(1H,brs,H-2),6.68(1H,d,J=2.5 Hz，H-7),3.95(3H,s,OCH3),2.45(3H,s,CH3);13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ:190.6(C-9),182.0(C-10),166.8(C-1),166.0(C-8),163.6(C-3),149.3(C-6),135.4(C-4a),133.4(C-10a),124.5(C-7),122.0(C-5),114.0(C-9a),110.8(C-8a)，108.5(C-2),106.8(C-4),56.3(OCH3),22.3(CH3).以上数据与文献[9]报道的数据基本一致，鉴定为大黄素甲醚(Physcion).

化合物8：白色晶体(氯仿),EI-MSm/z：447[M+Na]+;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:4.69(1H,d,J=2.3 Hz,H-29b),4.57(1H,d,J=2.3 Hz，H-29a),1.68(3H,s,H-30),1.08(6H,s,H-23,26),1.04(3H,s,H-24),0.96(3H,s,H-27),1.03(3H,s,H-24),0.94(3H,s,H-27),0.94(3H,s,H-25),0.80(3H,s,H-28);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:39.7(C-1),34.2(C-1),218.2 (C-3),47.3(C-4),55.0(C-5),19.8(C-6),33.7(C-7),40.9(C-8),49.9(C-9),37.0(C-10),21.6(C-11),25.3(C-12),35.3(C-13),42.9(C-14),27.5(C-15),35.6(C-16),43.1(C-17),48.4(C-18),48.0(C-19),150.8(C-20),30.0(C-21),40.7(C-22),26.8(C-23),21.1(C-24), 15.9(C-25),15.8(C-26),14.6(C-27),18.0(C-28),109.4 (C-29),19.2(C-30).以上数据与文献[10]报道的数据基本一致，鉴定为羽扇豆酮(Lupeone).

3 结语

本文运用现代分离分析技术研究了止血藤的化学成分,从其乙醇提取物中分离并鉴定出8个化合物,其中包括3种化学成分类型，有4个甾醇类、2个蒽醌类和2个三萜类,且所有化合物均为首次从该植物中分离得到.

参考文献:

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2010:180.

[2] 云南省食品药品监督管理局.云南省中药材标准(傣族药)[M].3版.昆明：云南科技出版社，2007.

[3] 白素平，范秉淋，闫福林.东风菜中甾体成分研究[J].新乡医学院学报,2005,22(3)：185-187.

[4] CHAMPAVIER Y, COMTE G, VERCAUTEREN J, et al. Norterpenoid and sesquiterpenoid glucosides from Juniperus phynicea and Galega officinalis[J]. Phytochemistry, 1999, 50(7): 1219-1223.

[5] GASPAR E M M, DAS NEVES H J C. Steroidal constituents from mature wheat straw[J]. Phytochemistry, 1993, 34(2): 523-527.

[6] LEE Ching-kuo, LU Chung-kuang, KUO Yuen-hsiung.New prenylated flavones from the roots of ficus beecheyana[J].Journal of the Chinese Chemical Society，2004，51：437-441.

[7] SIDDIQUI S, HAFEEZ F, BEGUM S, et al. Oleanderol, a new pentacyclic triterpene from the leaves of Nerium oleander[J]. Journal of Natural Products, 1988, 51(2): 229-233.

[8] 王振月，左月明，康毅华.毛脉酸模型化学成分研究(II)[J].中草药，2005,36(11)：1626-1629.

[9] 王钢力，侯钦云，张继等.春根藤的化学的研究(I)[J].中国中药杂志，2002，27(2)：125-127.

[10] 包淑云,林文翰.红树植物尖瓣海莲的化学成分研究[J].中国中药杂志，2006,31(14)：1169-1170.