重组蛋白免疫原性的研究进展

朱彩云,冯春颜,崔晓阳,吴文权,朱飞,罗国胜

(广东省深圳市龙华新区人民医院检验科,深圳 518109)

重组蛋白免疫原性的研究进展

朱彩云,冯春颜,崔晓阳,吴文权,朱飞,罗国胜

(广东省深圳市龙华新区人民医院检验科,深圳 518109)

重组蛋白是目前最为常见的生物药剂之一,但因其具有不同程度的免疫原性,临床应用时存在诱发免疫反应的潜在危险,一定程度上限制其在临床上的推广应用。该文介绍了目前报道的重组蛋白诱发免疫反应的机制及其引起免疫原性的原因,并对当前评价重组蛋白免疫原性的方法及降低其免疫原性的途径进行综述。

生物药剂;重组蛋白;免疫原性

随着重组DNA技术的广泛应用,大规模生产与内源蛋白相同或相似的高纯度重组蛋白成为可能,如凝血因子Ⅷ、促红细胞生成素、干扰素等。研究该技术的初衷是为了大批量获得相应的产品,在此基础上尽可能降低免疫原性,确保临床用药安全,但无论是异种治疗蛋白、人源重组蛋白、人源化重组蛋白都存在不同程度的免疫原性[1],临床应用时有诱发免疫反应的潜在危险。治疗蛋白生产过程的复杂性和其本身内在的不稳定性是其诱发机体发生免疫反应的关键[2]。笔者着重介绍重组蛋白诱发免疫反应的机制及影响其免疫原性的相关因素,并对当前评价重组蛋白免疫原性的方法及降低其免疫原性的一些策略进行简述。

1 免疫反应的机制

重组蛋白诱发免疫反应的机制有以下两方面。一是经典的免疫反应(即速发型反应),例如某些用于治疗先天相关基因缺陷患者的某些重组蛋白(比如生长激素、凝血因子Ⅷ等),会成为有效的异种蛋白而诱发经典的免疫反应。其特点在于用药一次就可能发生,且概率较高;一般产生中和性抗体,体内持续时间较长。二是打破免疫耐受——重组蛋白诱发免疫反应的主要机制。相对于经典的免疫反应,打破免疫耐受是一个相对缓慢的过程,需要几年的时间才可能有临床表现,概率较低;停止治疗或长期治疗,抗体可以消失。例如,重组促红细胞生成素通过打破免疫耐受诱导机体产生自我抗体,最终发展为单纯性红细胞再生障碍[3]。

2 免疫原性存在的原因

重组蛋白的生产使用过程是引起重组蛋白免疫原性的主要因素,可分为生产相关因素和治疗相关因素[4]。

2.1 生产相关因素 生产过程中的不稳定性因素(纯化、曝光、冷藏运输等)影响重组蛋白的三维结构,使其发生变性(聚集、氧化),从而诱发机体的免疫反应。

一方面,免疫原性存在或增强可能与重组蛋白生产过程中聚合形成微粒体有直接的关系,聚合的蛋白质通过暴露新的表位或已有的表位来增加其免疫原性,微量聚合就能明显增加其免疫原性[5]。欧洲临床广泛使用的药物Eprex(一种促红细胞生成素),其使用后会引起的单纯性红细胞再生障碍,原因在于组分中高浓度的聚山梨醇酯80促进重组促红细胞生成素形成了聚合的微粒体,诱发机体发生了自我免疫[3]。BRAUN等[5]建立了正常的Balb/c小鼠和转基因免疫耐受小鼠两个实验模型来研究干扰素(interferon,IFN-α)组分中聚合的蛋白成分和IFN-α免疫原性的关系,发现没有免疫原性IFN-α单体聚合后能转化为有免疫原性的聚合体;将这些聚合体注射到抗原提呈细胞和处理细胞相互协作的微环境中,会明显增加诱导免疫反应的机会。当然,也并非所有的分子聚合体都会增强重组蛋白的免疫原性。HERMELING等[6]认为聚合分子的大小和免疫原性的强弱没有明显的关系,并不是聚合的分子越大,免疫原性就越强,PUROHIT等[7]通过研究热应激得到的聚集的rFⅧ(重组凝血因子Ⅷ),其免疫原性并没有增加。

另一方面,蛋白质的修饰过程、生产过程中的环境影响(加热、冷冻干燥等)等均可导致蛋白质的错误折叠[8]。蛋白质的错误折叠是蛋白质的一个内在性问题,与一些退行性疾病相关(如阿尔茨海默病),其淀粉样变的病变组织可以激活免疫系统,诱导机体产生抗体。MAAS等[9]研究发现蛋白的折叠错误能打破免疫耐受。生物药剂存在淀粉样变的内在特性,在外界压力的条件下会增强,其诱发免疫反应强度和错误折叠程度呈正相关性,这种量效关系不仅影响到打破免疫耐受的概率,同时也影响到抗体升高的程度。

此外,产品包装会潜在地增加蛋白产品的免疫原性。玻璃表面、润滑剂、塑料和橡乳胶中的邻苯二甲酸酯会污染产品,增加其免疫原性。因此重组蛋白的批量生产过程中对产品的包装不可忽视[10]。

2.2 治疗相关因素 用药剂量和时间、给药途径、用药者的遗传背景以及并发的疾病和相伴随的治疗也会影响重组蛋白的免疫原性。一般认为,皮下注射给药较肌内注射和静脉注射易诱发免疫反应。但也有研究认为,给药途径本身和蛋白的免疫原性无关,但给药途径可以增加发生免疫反应的概率[11]。

3 评价免疫原性的方法

传统的临床应用前评价免疫原性的检测方法是通过动物实验来完成,主要检测啮齿类和非人类的灵长类血清抗体[12]。韩国柱等[13]曾经讨论种属特异性对蛋白多肽药物的影响,认为相同的实体在不同种属之间有所不同。这就有可能使一种活性蛋白在不同种属试验时变得无活性,且成为一种异物而导致免疫原反应,但是动物实验虽有不足之处,却是临床应用前很必要的环节,对临床用药有一定的指导意义[14]。目前动物研究的灵长类和转基因鼠模型是临床应用前评价重组蛋白免疫原性的两个常用的模型。转基因鼠较灵长类来源较容易,可以特定地表达人类基因,对转入基因所表达的特定人源蛋白产生耐受,已用于检测含有低水平的重组IFNα-2b聚合蛋白质[15]。

此外,已有研究者通过检测免疫细胞最终分泌的细胞因子,实现体外应用树突状细胞先与重组的IFN体外共同培养,然后加入自体来源的CD+4T细胞进行共同培养,最终用酶联免疫斑点法和腺苷增殖法进行评估来检测注射液组分的免疫原性,避免了动物与人之间的差异因素[16]。

4 降低免疫原性的策略

重组蛋白诱导免疫反应必须和几种经典的免疫细胞相互反应,包括抗原提呈细胞、T细胞、B细胞等。每种细胞识别独特的抗原,阻断其中任何一个环节即可明显降低临床发生免疫原性的概率[14]。

TANGRI等[17]通过重组蛋白——促红细胞生成素实验,验证了重组蛋白的免疫原性和若干免疫辅助性T细胞表位有关,可以通过修饰改变重组蛋白分子表面的这些相关表位来减弱其与主要组织相容性复合体分子的结合力,进而降低免疫原性,这一研究表明系统地、有预测性地降低重组蛋白的免疫原性的可能。TANGRI等[18]描述了一门整合的生物信息学——Immuno Stealth,解释了关于重组蛋白应用后发生免疫反应的生物化学和分子免疫学途径。“外源”的细胞表位通过序列分析和体外高通量的生物化学方法进行评价,然后用分子免疫学的方法进行确认,进而通过修饰改变其与人类白细胞抗原的结合力,使其不能被免疫系统识别。该技术的应用,将生产出更安全、更有效、更经济的重组蛋白。WIM等[19]认为应着重优化重组蛋白的分子设计及测定方法,以尽量降低其免疫原性的产生。

5 结束语

重组蛋白是一种极具应用前景的生物药剂,但往往因其存在一定的免疫原性,应用受到较大限制。

目前,完全预测重组蛋白免疫原性较为困难。明确重组蛋白在生产或储存过程中其免疫原性增加的可能因素,对减少重组蛋白免疫原性引起的副作用,提高生物药剂的质量具有一定的价值。动物模型和耐受人源蛋白的转基因动物的出现,虽然不可能完全预测重组蛋白在患者体内的免疫原性,但有助于系统研究重组蛋白的物理和化学变化与免疫原性之间的联系,可检测引起免疫原性的组分和结构变异,为进一步优化重组蛋白的组分和生产工艺提供基础。

体外应用树突状细胞蛋白产品的免疫原性及有预见性的设计与蛋白产品相似的抗原表位,干扰其与抗原提呈细胞的结合,从而降低产品的免疫原性,又不影响其本身的治疗特性是更有意义的降低免疫原性的办法。尽管已经有许多降低重组蛋白免疫原性的方法,对于所有的重组蛋白而言,临床试验阶段进行抗体的检测,以及售后药物监察仍是一项很重要的任务[20]。BEE等[21]认为将来会有某种特殊的蛋白质粒子在降低生物蛋白制剂的免疫原性以及其售后监测方面发挥重要作用。

相信将优化重组蛋白产品生产过程,建立正确的动物模型,以及建立体外检测方法等手段的结合,重组蛋白产品的免疫原性将会得到很好的预测,临床应用也会更安全、更广泛。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.020

R977.6

A

1004-0781(2014)12-1617-03

2013-12-16

2014-02-17

朱彩云(1980-),女,山西长治人,主管检验师,医师,硕士,主要研究方向:免疫学。电话:(0)13823361983,E-mail:zhucaiyun20051146@126.com。