肾细胞癌干细胞研究进展

陈健综述 金承洛审校

综 述

肾细胞癌干细胞研究进展

陈健综述 金承洛审校

肿瘤；肾细胞癌；干细胞

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC )的发病率在全身恶性肿瘤中占2%～3%[1]。肾癌细胞对化疗、放疗不敏感，具有多药耐药性[2]，而免疫治疗仅对10%～20%患者有作用，手术切除是目前治疗肾癌的首选，但肾癌术后复发、转移率高达40%[3]。2001年Reya等[4]提出了肿瘤干细胞学说，近年国内外对RCC干细胞进行大量的研究，并关注RCC干细胞的靶向治疗，希望找到RCC干细胞的特异性较高的表面标志物，探索RCC干细胞生存微环境，进而找到治疗肾癌的新途径，下文就近期肾癌干细胞的研究现状作一综述如下。

1 肿瘤干细胞及肾癌干细胞理论

在过去相当长的一段时间里， 肿瘤被认为是由肿瘤细胞构成的均一组织，每个恶性肿瘤细胞都具备无限的增殖能力，只要生长环境适宜，每个肿瘤细胞都具有致瘤能力。1958年，Hewitt[5]把小鼠急性髓系白血病肿瘤细胞移植到同品系的小鼠体内，发现这批移植小鼠体内多数没有形成肿瘤，仅有1%～4%能够形成脾脏内克隆，因此他们认为不是每个肿瘤细胞都具有无限的增殖能力，肿瘤细胞的致瘤能力可能是通过一小部分细胞表现出来的。数十年后，肿瘤干细胞学说的提出，认为肿瘤细胞之间存在固有差异[6]，在肿瘤组织中存在一小群具备自我更新和不定分化潜能的细胞，是肿瘤形成的起始细胞并维持肿瘤的生长，而其他绝大部分肿瘤细胞只具备有限的增殖能力。Al-Awqati等[7]提出了RCC干细胞的假设，认为RCC主要是由致癌性能的RCC干细胞和无致癌性能的其他细胞组成，RCC干细胞很可能是RCC的种子细胞，可能来源于近端肾小管祖细胞等肾脏细胞。Bonnet 等[8]成功分离出人类AML干细胞，肿瘤干细胞假设的理论逐步得到了证实。此后在脑肿瘤[9]、前列腺癌[10]等实体瘤中也证实了肿瘤干细胞的存在。目前认为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)/(tumor stem cells，TSCs)是一群存在肿瘤组织中数目极少的干细胞样细胞，具有干细胞所具有的自我更新能力和多向分化增殖潜能，是肿瘤发生、发展、转移的起始细胞[11]，肿瘤干细胞理论仍处起始阶段，我们所说的肿瘤干细胞，是因为这种细胞在某些方面表现出了干细胞的特性，所以有些文献称之为Cancer stem-like cells 或tumor-initiating cells 。

早在肿瘤干细胞理论提出之前,Bander 等[12]应用单克隆抗体探针技术研究肾癌细胞起源的过程中发现肾癌组织中，小部分细胞表型和正常胎儿近端肾小管祖细胞表型一致，表达相同的抗原。胚胎时期的肾脏细胞和小部分的肾癌组织细胞均产生大量转化生长因子α((TGF-α)，而正常成熟肾脏细胞则没有检测到此因子的表达。根据以上结果可推断，RCC细胞中小部分细胞的特性与胚胎时期肾脏部分细胞极为相似，提示了RCC干细胞存在可能。直到2005年，Florek 等[13]利用体外球体形成实验从肾癌细胞中首次发现RCC干细胞，证实了肾癌干细胞的存在。目前基于肾癌组织中这种干样细胞存在的理解有2种：(1)这种表现出干细胞特性的干样细胞可能是位于肾癌组织中的正常肾脏干细胞，在肿瘤组织中促进肿瘤生长和血管形成；(2)也可能是正常的肾脏干细胞恶化后形成的最原始的肿瘤细胞，在不同微环境诱导下分化形成具有不同特性的肿瘤细胞群，进而形成不同病理类型和不同恶性程度的肿瘤组织。

2 肾癌(肿瘤)干细胞标志物

2.2 三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2( ATP-binding cassette transporter,ABCG2)ABCG2 作为一种跨膜转运蛋白,是由655个氨基酸组成的，具有6个跨膜区和1个核结合区[17]。当用DNA荧光染料Hoechest33342对不同的细胞进行染色时，某些肿瘤细胞和干细胞表现为细胞核不着色或者很低程度的着色，研究者们将这部分细胞称为侧群(SP)细胞，SP细胞高表达ABCG2。研究者们证实肾癌组织中分布有SP细胞，也高表达ABCG2。肾癌具有对化疗不敏感、多药耐药性的特点，而ABCG2的主要作用恰恰就是把包括化疗药物在内的多种药物泵出细胞外[18]，进而使得肿瘤组织表现出耐药性。由此可以推测SP细胞标记物ABCG2在肾癌的耐药中可能起着关键的作用，所以ABCG2有理由成为肾癌干细胞的表面标志物，但是其特异性还有待检测。

2.3 Oct-4 Oct-4是一种在胚胎干细胞和精原细胞中表达的转录因子，是维持胚胎干细胞的多分化潜能的重要因子，增殖不旺盛或者成熟的分化组织中一般检测不到Oct-4的存在，通常认为是胚胎干细胞的标记物。研究者们发现Oct-4在绝大多数的RCC标本中呈阳性表达[19]，而正常肾皮质组织和癌旁组织中未检测到Oct-4表达。Oct-4已经证实的作用为维持细胞的分化潜能[20]，癌组织中只有一小部分细胞具有这种能力，Oct-4可能就表达在肿瘤干样细胞。研究者们只是证实了肾癌组织中Oct-4的高表达，还未能在单个特定细胞上明确其表达。

2.4 BMI-1 BMI-1基因是多梳基因(polycomb group gene)家族重要的调节基因，调节同源盒基因的转录，抑制细胞周期蛋白激酶抑制基因p16Ink4a表达，在维持正常干细胞自我更新和多向分化方面起到重要作用。BMI-1的表达主要分布于胞浆，大部分呈弥漫性全浆分布，少数分布于胞核或胞核周围[21]；研究表明BMI- 1表达阳性率与肾透明细胞癌的分化程度呈反比,推测其参与了肾癌的发生，Liu 等[22]发现BMI-1 的表达与肿瘤组织内干样细胞对肿瘤组织的调节有关。除肾癌外，BMI-1基因在维持促白血病干细胞、乳腺癌干细胞等肿瘤干细胞增殖能力方面的作用已经得到证实。因此有理由根据BMI-1 的表达鉴别肾癌干细胞。

3 肾癌干细胞的培养及筛选方法

3.1 SP细胞分选法 基于肿瘤干细胞细胞膜上ABCG2跨膜转运蛋白能将DNA结合染料排出细胞而不被染色的特性，采用荧光激活细胞分类术(FACS)技术就可以从单细胞悬液中分选出不染色的SP细胞。

3.3 体外球体形成实验 体外球体形成实验已经被认为是一种有用的肿瘤干细胞的培养和分离方法。从脑肿瘤组织中分离得到的细胞悬浮于含有表皮生长因子(EGF)和成纤维生长因子(bFGF)的无血清培养基中培养，小部分细胞能生长为一个细胞球体[23]。这部分细胞展现出自我更新能力、更高的干细胞样基因mRNA表达水平，更强的致瘤性以及对抗肿瘤药物的更顽强的抵抗能力。有研究证实[24]，在非附着培养条件下，以多细胞球或者球形细胞聚集体方式形成集落的能力是许多具有自我更新能力细胞的一种特点。在此方法指导下，2005年Florek等[13]从肾癌组织中发现肾癌干细胞的存在。

3.4 利用干细胞慢周期的特性分离提取 溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)能够在细胞处于S期时，渗入细胞中标记到新合成的DNA链中，能够标记到细胞周期较长的成体干细胞中并能保留较长的时间，在细胞免疫组化中应用广泛。2004年，Oliver等[25]利用BrdU此特性，追踪观察了正常肾脏干细胞，发现肾乳头是肾脏干细胞集中的部位。这种细胞在肾脏受到损伤，特别是缺血性损伤的时候就会进入细胞周期，参与病损修复。体外培养这种细胞，表现出极强的增殖能力和多能性[26]，因此认为这些细胞就是肾脏干细胞，关于肾癌干细胞，目前还没有用此染料追踪寻找的案例，但Oliver的实验对于肾癌干细胞的筛选具有指导意义。

4 以肿瘤干细胞为靶点治疗癌症的初尝试

分析肿瘤干细胞表面特异性标志物，寻找到肿瘤干细胞特异性表达抗原，根据此标志物抗原，寻找及利用相应抗体，达到抗肿瘤干细胞的作用，从而起到抗肿瘤的作用。此方法首次在AML中取得了突破性进展，研究者们用一种肿瘤干细胞标志物CD44的抗体[28]，清除了接种AML的免疫缺陷小鼠体内的AML干细胞。此方法尚未在实体肿瘤中尝试过，但对于肾癌等实体肿瘤具有指导意义。

研究者发现利用细胞因子IL-15处理肾癌干细胞，对常规抗肿瘤药物更敏感[29]。Azzi等[30]利用对比实验证实接触过白介素-15的肾肿瘤组织对顺铂、长春碱、紫杉醇等常规抗肿瘤药物更敏感。对比结果示IL-15处理后的标本肾癌干细胞的数量明显减少，IL-15如何导致肾癌干细胞减少的机制不明确，但是肾癌干细胞较少的肾癌组织对抗肿瘤药物敏感，很有可能是由于肾癌干细胞缺失，降低了肾癌组织耐药性所致[31]。

5 意义及展望

肿瘤干细胞理论的提出，使人们对包括肾癌在内的多种恶性肿瘤的认识发生了革命性的变化，基于肾癌干细胞的研究进展，进一步推动了对肿瘤干细胞各种生物学特征和生物学行为分子机制的探索，为重新认识肿瘤的起源和本质，以及肿瘤的临床治疗提供了新的明确可靠的方向。

但是，作为目前生命科学领域的研究热点，肿瘤干细胞研究在面临巨大机遇的同时也面临巨大挑战。正如前文所述，肿瘤干细胞的起源问题还未定论；其特异性的表面标志物[32]和独特的信号通路还有待于进一步的寻找和认识；分离和鉴定技术还不是十分成熟等。肾癌干细胞的研究起步较晚，与乳腺癌干细胞、脑胶质瘤干细胞等相对较成熟的肿瘤干细胞研究相比，肾癌干细胞研究处于起始阶段。随着干细胞研究技术和应用水平的不断深入，肾癌干细胞特异性标志物、基因靶位将会逐步被发现，P13K-AKT-mTOR、EGFR、Wnt等[33]信号通路与肿瘤的关系将更加明了；肾癌干细胞特异细胞周期与不对称分裂的机制将被明确、利用微环境的调控及靶向药物治疗肾癌将成为可能，到那时肾癌等恶性肿瘤会被彻底根治，造福人类。

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150086 哈尔滨医科大学第二附属医院泌尿外科

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10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.08.038

2014-03-14)