分子标记技术在果树育种研究中的应用

傅明洋 赵春生 李德洪 朱学亮

山东省德州市林业局果树站·253046

1 分子标记技术

分子标记是一种以生物体内遗传物质——核酸（DNA）的多态性为基础的遗传标记，是随着各种生物技术的不断创新而进步和发展的，经历了从基于酶切的限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP），到基于微卫星的简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR），再到以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）为基础的随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD），一直到以酶切和PCR相结合的扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphis，AFLP）。 与形态标记、细胞学标记和同工酶标记相比，分子标记具有多态性高，检测方法简便、快捷，不受环境条件影响等优点。分子标记的产生和发展为当代果树育种工作提供了新方法、新思路，充分体现了生物技术革新带来的促进作用。

2 分子标记术在果树育种中的应用

分子标记技术的诸多优越性，已经被广泛应用于果树遗传图谱构建、重要农艺性状的基因定位、遗传多样性与亲缘关系分析、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种等方面，并取得了惊人的成绩。

2.1 亲缘关系与遗传多样性 分子标记数量巨大，广泛存在于基因组DNA的各个区域。通过对基因组中分子标记的多态性进行比较，能够准确区分同一物种不同的基因型，甚至是亲缘关系相近的材料，从而揭示其遗传本质。张开春和李荣旗用38个RAPD引物对平邑甜茶的遗传一致性进行分析，共获得173条稳定的DNA谱带，其中仅有2条谱带表现出多态性，进一步证明了通过无融合生殖的平邑甜茶具有较高的遗传一致性。Geibel等将RAPD和ISSR相结合，用来分析新疆野苹果的遗传多样性，发现来自中亚的7个群体有很大的遗传差异。Lin等利用AFLP对中国梨属的10个种做了亲缘关系分析，结果表明，供试材料在遗传距离为0.166～0.169时被分为两大类，一类为原产于中国的8个种，其中遗传距离最近的白梨和砂梨首先聚在一起；另一类由西洋梨和杏叶梨组成。高源等利用筛选出的12对SSR引物分析苹果属资源的亲缘关系，共获得176个等位基因，其中3对引物就可以将所有59份材料加以区分；聚类图中，具有亲本血缘的品种紧密聚在一起，亲本相同的个体也有较高的遗传相似系数，起源于新疆野生苹果与地方品种交错在一起，反映了其复杂的遗传关系。徐兴兴等利用SSR分析了20个苹果栽培品种的遗传多样性，将供试苹果品种分为四大类，与传统系谱分类基本一致，并初步建立了苹果品种的SSR基因型图谱库。Yan等采用RAPD分析了新疆野苹果群体的遗传多样性，结果表明，83.1%的遗传多样性存在于群体内部，远远高于群体之间的遗传多样性。Zhang等通过对4个新疆野苹果群体进行SSR分析，确定了新疆野苹果遗传多样性水平远高于栽培品种，揭示了新疆野苹果丰富的遗传多样性。

2.2 遗传连锁图谱构建与基因定位 遗传图谱既是遗传学研究的重要内容，又是分子育种工作的理论基础。构建高密度分子遗传图谱对于基因定位至关重要，图谱上包括的标记数量越多，分布越均匀，则基因定位就越精细。King构建的欧洲苹果遗传图谱包括了控制生长、果实性状、抗病性、抗寒性等基因的标记。Maliepaard等利用Prima×Fiesta产生的152株实生苗为作图群体构建了一份苹果连锁图谱，此图谱成为以后几年苹果基因组研究的重要参考资料，含17个连锁群，对应苹果的17条同源染色体，Prima连锁群平均长度为50 cM，Fiesta连锁群平均长度为58 cM，比一般农作物（100～150 cM）小得多，包含 200多个标记 （30多个 RAPD、24个同功酶，124个RFLP，10 个 SSR，9 个 AFLP 标 记 和 1 个SCAR标记），是苹果基因组研究的一张核心图谱。Dalbó等以58个杂交后代为作图群体，对早期构建的一份葡萄连锁图谱进行加密，将 25个 SSR、4个 CAPS以及 12个 AFLP标记重新定位在该图谱上，并且发现了一个与性别基因紧密连锁的SSR标记。Liebhard等在前人研究的基础上以Fiesta×Discovery群体构建了当时最完整、饱和度最大的苹果遗传连锁图谱，其中大量的共显性标记，使该图谱可以快速转移到其他物种中。该图谱包含840个分子标记（475 个 AFLPs，235 个 RAPDs，129个SSRs和1个SCAR标记），与以前的遗传图谱相比共增加了511个新的分子标记。高密度分子遗传图谱的绘制使部分植物的遗传学研究取得重大进展，并对分子标记辅助选择和基因图位克隆技术的发展产生了巨大的推动作用。Howad等利用扁桃与杏构建的F2群体，从401对SSR引物中筛选出的264个SSR标记定位在已有的李的遗传图谱上，从而提高了该图谱的饱和度。曹珂等以桃与山桃的杂交后代为作图群体，采用多种分子标记构建包了含11个连锁群的遗传图谱，同时将雌蕊发育和单瓣/重瓣基因进行定位，为这2个基因的克隆及遗传转化奠定基础。

2.3 种质资源鉴定 果树生命周期长，并且长期通过无性方式繁殖，加上不同地域间的相互引种，同名异物和同物异名现象十分普遍。如何准确地对现有果树品种进行鉴定和分类，是进一步科学、有效地利用果树资源的基础。过去进行品种分类和鉴定主要采用比较植物学形态特征，并结合细胞学、胞粉学和酶学等方法，但都有其局限性，因误差大、效率低，而不能对性状相近的材料准确区分。分子标记建立在基因组DNA多态性基础上，标记数目多、检测迅速，是绘制指纹图谱的强有力工具，能够对果树品种进行准确的鉴定与分类，对保护我国名、特、优果树品种及新育品种的知识产权具有重要意义。罗正荣用RAPD技术鉴定柿树，仅用1条引物就区分了15个品种。Botta等用4对引物对24份意大利葡萄品种进行鉴定，除Favotita、Pigato和Vermentino 3个品种扩增片段一样，可能为同物异名外，其它品种均可以区分开。Guifford等用3个SSR标记将21份苹果品种区分开。周爱琴等以筛选出的OPQ15为引物，绘制了19种苹果砧木基因型的DNA指纹图谱，区分了其中的17种，区分效率达95%。唐建民等对小金海棠和山荆子的79株杂交后代进行RAPD分析，并用SSR对RAPD的初步鉴定结果进行验证，结果显示，RAPD鉴定出的杂种实生苗有72.2%得到SSR标记的证实。韩宏伟等根据数据库中的DNA序列设计开发SSR引物，用筛选出的6对SSR引物可以对19份梨的主要栽培品种进行鉴别。

2.4 分子标记辅助选择育种 分子标记辅助选择就是通过遗传标记对目标性状进行间接选择。通过分子标记分析，可以在早期选择与目标基因（性状）紧密连锁的DNA片段作为辅助育种的标记，大大缩短育种周期，从而省时、省力，并且其结果因不受其它基因效应和环境因素的影响而较为可靠。分子标记辅助选择在果树育种中主要应用于杂种实生苗的早期鉴定，杂交亲本的选配，雌雄异株果树幼苗的鉴定，多种抗病性状的同时筛选，染色体片段去向追踪，遗传转化中目的基因的检测等方面。田义轲等将苹果柱型基因的AFLP标记转化为SCAR标记，发现该标记对苹果柱型性状检测的准确率达90%以上，可以用于柱型苗木的早期鉴定及柱型苹果杂交育种中对群体材料的早期选择。Warburton等利用分子标记结合群体分离分析法 （Bulked segregation analysis，BSA），从油桃和桃的杂交后代中筛选出与果肉硬度、离核以及黄肉性状连锁的RAPD标记。Hormaza用RAPD和胚培养技术对樱桃进行早期育种选择，能够判断出用混合花粉授粉后所得到胚的父本。Katula-Debreceni等利用SSR技术得到两个白粉病抗性基因，并且成功地对葡萄杂种群体中的抗病个体进行早期选择，大大降低了后代中的感病个体，充分显示了分子标记辅助育种的优越性。

3 展望

实践证明，分子标记技术具有很强的实用性，为传统果树育种工作提供了有力的辅助手段，使育种研究的目的性与效率得到提高。尽管分子标记技术有许多优势，但作为一种技术方法，任何分子标记技术均不能满足作为理想遗传标记的所有要求，这就要求育种工作者在实际工作中要结合育种目标，选择合适的分子标记，制定完善的育种计划，充分发挥分子标记的技术优势。可以相信，随着更多果树基因组测序工作的完成，以及功能基因组学与生物信息学的深入发展，分子标记技术在果树育种工作中的应用必将有更广阔的前景。

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