鬼臼毒素及4'－去甲基鬼臼毒素对黄曲条跳甲的拒食活性研究

赵 慧，徐 迪

(华南农业大学资源环境学院，广东广州 510642)

黄曲条跳甲Phyllotreta striolata Fabricius属鞘翅目叶甲科［1］，主要危害十字花科蔬菜，尤其对油菜等经济作物有较严重的危害［2］.目前对黄曲条跳甲主要采用化学方法防治，且多以防治成虫为主，叶面喷药无法兼顾土中幼虫、蛹和卵，药剂持效期一过，成虫不断羽化出土为害，使得喷药次数和药量增加，害虫产生抗性，加重农药残留和环境污染.

寻找高效、快速、方便、经济且活性高、毒性小的植物次生物质，并通过化学结构上的修饰或模拟等方法获得的植物化合物是当前的研究热点［3-4］.利用植物的次生物质来防治黄曲条跳甲是保护农作物的途径之一［5］.已有研究表明多种植物次生物质对黄曲条跳甲成虫具有选择性和非选择性拒食作用［6-10］.多项研究显示鬼臼毒素及其衍生物对菜粉蝶Pieris rapae、粘虫Mythimna separata等鳞翅类害虫和鞘翅类昆虫均有拒食、毒杀、抑制生长发育等作用［11-12］.对鬼臼毒素进行结构修饰获得的衍生物能扩大杀虫范围和提高杀虫活性［13］.笔者研究了鬼臼毒素及其衍生物4'-去甲基鬼臼毒素对黄曲条跳甲的拒食活性，鬼臼毒素具有抗肿瘤、抗病毒作用，其衍生物能降低药物副作用［14］，因此将鬼臼毒素及其衍生物用于黄曲条跳甲防治，对人类健康和环境没有危害，鬼臼毒素及其衍生物有望成为防治黄曲条跳甲的一种新型生物农药.

1 材料与方法

1.1 供试材料和仪器

窝儿七Rhizoma et Radix Diphylleiae Diphylleia sinensis Li购自广州清平中药市场;黄曲条跳甲成虫采自华南农业大学试验基地并无农药饲养2代;吐温、石油醚(60-90)、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、无水甲醇等溶剂(均为分析纯)为天津化学试剂一厂生产;柱层析硅胶(100～200目)、薄层层析硅胶(H与GF254)为青岛海洋化工厂有限公司生产;羧甲基纤维素钠(CMC)为上海化学试剂分厂生产.Varian Unity INOVA500型核磁仪(美国Varian公司);VGAutospec-500质谱仪(美国Beckman公司);FINNIGAN TRACE GC-MSTM，TR201818(美国 Thermo Finnigan公司).

1.2 窝儿七次生物质的提取分离

取窝儿七干燥茎根粉末1 kg，加φ为95%的乙醇溶液浸没生药粉，加热回流2 h，过滤，残渣再加φ为95%乙醇溶液回流1 h，浓缩乙醇提取物至糖浆状，放冷，倾入500 mL水中，黄棕色树脂状沉淀析出.滤集沉淀，得窝儿七树脂.将树脂研碎后用三氯甲烷450 mL分3次分散溶解，分成三氯甲烷溶解部分和不溶部分.

将三氯甲烷溶解部分蒸出三氯甲烷后，残渣在苯和φ为95%乙醇的混合溶液(体积比1∶1)中重结晶，放置过夜，得鬼臼毒素.将不溶物采用硅胶反复柱层析，用石油醚/乙酸乙酯(体积比 100∶0、80∶20、50∶50)溶液洗脱得4'-去甲基鬼臼毒素.

1.3 鬼臼毒素类似物结构鉴定

采用FINNIGAN TRACE GC-MSTM分析化合物结构［10］.气相色谱进样口温度230℃，载气为氦气，流速5 mL·min-1，非极性柱 BP-5［30 m ×0.32 mm ×0.25 mm］，初始柱温100℃保持5 min，以10℃·min-1程序升温至200℃，保持5 min，以5℃·min-1线性升温至 220 ℃，保持 3 min，分流比20∶1.TR201818 MSTM:电压70 eV，质核比 m/z35～335 amu，借助 Wiley＆Mainlib数据库分析化合物结构.

1.4 窝儿七化合物不同浓度对黄曲条跳甲成虫的

非选择性和选择性拒食作用的测定

将化合物鬼臼毒素、4'-去甲基鬼臼毒素用φ为50%丙酮溶液和φ为0.3%吐温水溶液配制成500、1 000、2 000、3 000 和4 000 μg·mL-15 个质量浓度.采集较嫩的甘蓝无虫孔叶片，选择叶面平整，厚度接近的叶片，用打孔器(d=1.8 cm)制备成圆形叶片.用小毛笔蘸取适量溶液，每片叶片正反面均匀涂药2次，晾干.对照叶片涂未加待测样品的空白溶液.用培养皿和透明塑料硬纸制成高为10 cm的养虫笼，下方培养皿中放置潮湿滤纸保湿.上方的培养皿用保鲜薄膜封好，防止虫子跑出.

非选择性拒食作用的测定:每个笼子放6片涂样小叶，接10头黄曲条跳甲成虫，为1个处理，每处理3个重复.24和48 h后分别用九宫方格图版记录成虫取食面积.

选择性拒食作用的测定:培养皿中滤纸用铅笔画1个“十”，将其平均分成4个区域，其中不相邻的区域放涂有试样的叶片4片，并作上标记，另外2个区域放空白对照的叶片4片，接10头黄曲条跳甲成虫，为1个处理，每处理3个重复.24和48 h后分别用九宫方格图版记录成虫取食面积.

1.5 数据分析

采用SAS 9.1.3分析数据，非选择性拒食活性采用DMRT法进行分析，选择性拒食活性采用T检验法分析.对差异显著者，按下列公式计算拒食率，差异不显著者，不计算拒食率.

拒食率=(对照组取食面积-处理组取食面积)/对照组取食面积×100%.

2 结果与分析

2.1 鬼臼毒素及其类似物结构鉴定

图1 鬼臼毒素及其类似物的分子式Fig.1 Molecular structural formula of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin

2.2 窝儿七化合物不同质量浓度对黄曲条跳甲成虫的非选择性拒食作用

由表1可知，鬼臼毒素对照与处理差异显著，具有非选择性拒食活性，并随着质量浓度增加，拒食活性增加.在 24 h，浓度 500 μg·mL-1时，拒食率为43.49%，4 000μg·mL-1时，拒食率达93.79%，但浓度在1 000～4 000μg·mL-1范围内的拒食活性差异不显著.除3 000～4 000μg·mL-1浓度下的拒食活性差异不显著外，48 h各组间拒食活性差异显著，其拒食活性均低于相同浓度条件下24 h的拒食活性，但下降不显著.相同条件下，不同浓度4'-去甲基鬼臼毒素处理组与对照组就拒食活性均无显著差异.

表1 鬼臼毒素和4'－去甲基鬼臼毒素对黄曲条跳甲的非选择性拒食活性1)Tab.1 Nonselective antifeedant activities of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin against Phyllotreta striolata

2.3 窝儿七化合物不同质量浓度对黄曲条跳甲成虫的选择性拒食作用

由表2可知，鬼臼毒素对照与处理差异显著，具有选择性拒食活性，随着质量浓度增加，拒食活性增加.在500μg·mL-1时，24 h拒食率为46.12%，4 000 μg·mL-1时，24 h拒食率达最大，为100%.相等质量浓度下，48 h的拒食活性均比对应的24 h的活性略低，但下降不显著.4'-去甲基鬼臼毒素在1 000和4 000μg·mL-1浓度下24 h表现出拒食活性，4 000 μg·mL-1下48 h表现出拒食活性(53.03%)，其余拒食活性表现不显著.

表2 鬼臼毒素，4'－去甲基鬼臼毒素对黄曲条跳甲的选择性拒食活性1)Tab.2 Selective antifeedant activities of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin against Phyllotreta striolata

3 结论

植食性昆虫主要借助化学感受器来鉴别植物信号，而植物信号以植物次生物质为主.从鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素对黄曲条跳甲的拒食研究可知，鬼臼毒素在24和48 h对黄曲条跳甲的选择性拒食活性均高于非选择性拒食活性，表明鬼臼毒素对黄曲条跳甲具有更好的选择性拒食活性，且有一定的持效性.相比之下，4'-去甲基鬼臼毒素只在高浓度(4 000μg·mL-1)条件下，对黄曲条跳甲才表现出选择性拒食活性.鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素分子结构骨架相似，但拒食活性研究结果差异很大，可能与分子母核上所带官能团不同有关.鬼臼毒素比4'-去甲基鬼臼毒素多1个甲基，拒食活性也随之增大，推测可能是羟基的氢键作用阻碍了4'-去甲基鬼臼毒素与相关受体的结合，从而降低了拒食活性.类似作用也表现在鬼臼毒素的其他衍生物上，如鬼臼毒素C-4位引入氨基二苯醚基团后，发现该衍生物的选择性和杀虫范围增强，其杀虫活性也得到一定程度的提高［15］.

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【责任编辑霍 欢】