用于乙醇生产的‘热研4号’王草石灰预处理条件优化研究

高瑞芳，张腾飞，张建国

（华南农业大学农学院／农业部能源植物资源与利用重点实验室，广东广州 510642）

用于乙醇生产的‘热研4号’王草石灰预处理条件优化研究

高瑞芳，张腾飞，张建国

（华南农业大学农学院／农业部能源植物资源与利用重点实验室，广东广州 510642）

【目的】提高‘热研4号’王草Pennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4生产乙醇的转化率.【方法】采用石灰进行预处理，对时间、温度、石灰用量、固液比4个因素进行单因素和正交优化试验分析.【结果和结论】最优预处理条件为：时间3 h，温度125℃，原料的石灰用量0.15 g·g-1，固液比（m∶V）1∶12（g·mL-1）.此时‘热研4号’王草的干基失质量率、木质素移除率、半纤维素移除率和纤维素移除率分别为28.1%、65.4%、37.5%和6.1%.预处理的‘热研4号’王草经酶解后，半纤维素、纤维素和总酶解得率分别为43.5%、85.7%和55.2%，比未经处理的酶解得率分别提高了18.1、4.5和4.4倍.此外，影响酶解得率的主要因素是预处理时间和温度，其次是石灰用量和固液比.

‘热研4号’王草；石灰；预处理；乙醇生产

随着能源危机、粮食短缺和环境污染等问题的日益突显，各国纷纷开始研究可替代石油等石化资源且适合本国国情的生物质能源，其中，将生物乙醇作为可再生液体燃料资源逐渐引起各国的关注［1-3］.因此，为了使燃料乙醇得到大规模的推广应用，应寻求不与粮食争地的乙醇生产原料［4-5］.木质纤维原料富含纤维素和半纤维素，如王草Pennisetumpurpureum×P.americanum、柳枝稷Panicumvirgatum、芦竹Arundodonax、芒草Miscanthusspp.等，因其丰富、廉价，将其作为生产燃料乙醇可再生原料具有广阔的发展前景［6］.

木质纤维原料细胞壁结构复杂，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中木质素作为黏合剂包裹在纤维素和半纤维素周围，使得纤维素的可及度极低.因此，纤维素酶对纤维素的水解率极低，一般为10%～20%［7］，因而需对原料进行预处理，除去木质素或破坏木质素层，使结晶纤维素成为无定型纤维素，以提高纤维素酶对纤维素的水解糖化效率［8-9］.石灰预处理可除去生物质中所有的乙酰基和部分木质素，促进纤维素和半纤维素的水解［10］，有利于后续的糖化和发酵［11］.石灰预处理的温度范围较宽（25～130℃），处理时间从几小时到几周，适当提高处理温度可缩短处理时间［12］.其优点还在于成本低、使用安全，且石灰溶液与二氧化碳反应生成的碳酸钙可利用石灰窑技术重新获得石灰［13］.Liang等［14］和Sierra等［15］研究表明，采用石灰代替氢氧化钠，可减弱预处理过程对设备的腐蚀作用，明显提高预处理后物料的酶解转化效率.Karr等［13］使用石灰对玉米秸秆进行了预处理，在固液比（m∶V）1∶5（g·mL-1）、每克原料的石灰用量0.075 g、120℃条件下处理4 h，其酶解率提高了9倍.Chang等［16］在150℃条件下用石灰处理薄白杨木板5 h，木质素去除率达77.5%，葡萄糖的酶解得率从7%提高到了77%.

‘热研4号’王草Pennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4是禾本科狼尾草属高秆多年生草本，原产于热带非洲，是象草P.purpureum和美洲狼尾草P.americanum的杂交种，以优质、高产而著称，被誉为“草中之王”［17］.1984年中国热带牧草研究中心从哥伦比亚引种到海南岛，试种成功

后逐步在全国各地推广.现已在海南、广东、广西、福建、四川、江西等地广泛栽培［18］.‘热研4号’王草形似甘蔗，根系发达，植株高1.5～4.5 m.具有光合作用能力和生物量较高，利用年限长，再生能力、适应性和抗逆性强等特点［3，19-20］.李高杨等［21］探讨了优质能源植物的筛选及评价指标，结果表明‘热研4号’王草是最适宜生产清洁生物质能源的能源草之一.本研究采用石灰对‘热研4号’王草进行预处理，对温度、时间、石灰用量、固液比4个因素进行了单因素和正交优化试验分析，以期为‘热研4号’王草作为能源草生产燃料乙醇提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

‘热研4号’王草来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所.于2012年2月29日种植，试验小区面积为14 m2（3.5 m×4.0 m），3次重复，小区间距100 cm.采用粗壮、无病害的茎芽作种茎，株行距60 cm.种植后于3月14日施肥、浇水，施肥量每小区均为622 g（N-P2O5-K2O有效养分质量分数为36%）.

1.2 样品处理

将株高3 m的‘热研4号’王草收获后带回实验室，机械切段1～2 cm，70℃烘干、粉碎、过40目筛，保存备用.

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验 在高压灭菌锅（YXQ-LS-50SⅡ，博迅实业有限公司医疗设备厂，上海）中，选取时间、温度、固液比、石灰用量4个因素在不同水平条件下进行预处理（表1）.反应结束后，冷却、中和、抽滤，收集滤液，用于测定干基失质量率，木质素、纤维素及半纤维素移除率.

表1 单因素试验选取的水平Tab.1 Levels of single-factor tests

1.3.2 正交试验 在单因素优化的基础上，选取时间、温度、固液比和石灰用量4个因素作为研究对象，设计L9（34）的正交试验（表2），研究其对‘热研4号’王草各组分的影响.

表2 石灰预处理的正交试验因素及水平Tab.2 The factors and levels of lime pretreatment orthogonal test

1.3.3 酶解试验 将预处理的烘干样1.0 g放入50 mL锥形瓶中，加入pH 4.8（0.05 mol／L柠檬酸缓冲液）含有纤维素酶20 U／g的酶液，固液比（m∶V）1∶20（g·mL-1），在温度45℃、转速150 r／min的条件下酶解48 h，每试验重复3次.酶解结束后过滤酶解液，使用高效液相色谱仪（岛津-GL，化兴科学仪器有限公司，广州）测定酶解液中的还原糖含量.

1.4 测定项目及方法

1.4.1 化学组分分析 纤维素、半纤维素和木质素含量在Van Soest法的基础上使用改进的滤袋分析法测定［22］；灰分含量采用灼烧法测定［23］.

1.4.2 还原糖含量测定 还原糖含量采用高效液相色谱仪测定，色谱条件：岛津色谱柱（3.5μm×4.6 mm×250 mm氨基柱）；RID-10A示差折光检测器；流动相为超纯水；流速1.0 mL／min；柱温45℃；进样量20μL.

1.4.3 计算 纤维素（半纤维素）酶解得率（%）＝（V×ρ×0.9）／（m×w×1 000）；总酶解得率（%）＝［（w1+w2）×0.9］／（m×w3）.其中，V为酶解液体积，mL；ρ为酶解液葡萄糖（木糖）质量浓度，g／L；m为预处理后残渣质量，g；w为残渣中纤维素（半纤维素）质量分数，%；w1、w2分别为纤维素、半纤维素质量分数，%；w3为残渣中纤维素和半纤维素质量分数之和，%.

1.5 统计分析

采用Excel和SPSS17.0软件对试验数据进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 ‘热研4号’王草原料的化学组分

‘热研4号’王草原料（干物质）的纤维素和半纤维素质量分数较高，可达39.9%和28.2%；木质素和灰分质量分数均较低，分别为11.6%和5.4%，所以比较适宜作为生产生物乙醇的原料.

2.2 单因素试验

2.2.1 预处理时间对‘热研4号’王草化学组分的影响 随着时间的延长，干基失质量率逐渐下降，其原因可能是石灰转化为不可溶性盐后，以盐的形式与草粉结合［24］.木质素的移除主要是在前4 h，0～2 h移除率为28.1%，2～4 h移除率增加17.5%，且4 h移除率显著高于2 h（P＜0.05），4～10 h间无显著差异（P＞0.05）.半纤维素的移除主要是在前2 h，移除率为30.1%；纤维素的移除量较少，主要是在前4 h，移除率仅为4.3%，各时间段均无显著差异（P＞0.05）（图1）.综合3种组分的去除效果，并考虑缩短时间和节约成本，采用4 h进行其他单因素试验.

图1 预处理时间对‘热研4号’王草化学组分的影响Fig.1 Effects of pretreatment time on the chemical composition of‘Reyan No.4’

2.2.2 预处理温度对‘热研4号’王草化学组分的影响 随着温度的升高，干基失质量率维持在17%～23%的水平.木质素移除率在90～120℃条件下由20.5%迅速上升到60.1%，120～130℃条件下无显著差异（P＞0.05）.半纤维素移除率在90～130℃条件下由29.7%增至43.7%，其中90～120℃条件下移除率迅速增大，120～130℃无显著差异（P＞0.05），说明温度对木质素和半纤维素的移除影响较大.纤维素的移除率在90～130℃间均无显著差异（P＞0.05），130℃移除率最高，仅为6.9%（图2）.所以，综合以上结果，采用120℃进行其他单因素试验.

2.2.3 预处理固液比对‘热研4号’王草化学组分的影响 随着固液比（m∶V）在1∶5～1∶15（g·mL-1）间干基失质量率从17.9%增至27.7%，差异显著（P＜0.05），而在固液比1∶15～1∶25（g·mL-1）间无显著差异（P＞0.05）.固液比在1∶5～1∶15（g·mL-1）间木质素移除率由20.9%上升至57.7%，半纤维素移除率由34.4%增高到47.8%，处理效果较好；而在固液比1∶15～1∶25（g·mL-1）间木质素和半纤维素的移除率仅分别增加2.4%和1.9%，处理效果无显著差异（P＞0.05）.纤维素移除率在固液比1∶5～1∶25（g·mL-1）间均无显著差异（P＞0.05）（图3）.综合以上结果和从节约成本角度出发，采用固液比1∶15（g·mL-1）进行其他单因素试验.

图2 预处理温度对‘热研4号’王草化学组分的影响Fig.2 Effects of pretreatment temperature on the chemical composition of‘Reyan No.4’

图3 预处理固液比对‘热研4号’王草化学组分的影响Fig.3 Effects of solid-to-liquid ratio on the chemical composition of‘Reyan No.4’

2.2.4 预处理石灰用量对‘热研4号’王草化学组分的影响 随着石灰用量的增加，干基失质量率基本维持在25%左右，对木质素、半纤维素和纤维素的影响均较大.当原料的石灰用量为0.05～0.15 g·g-1时，木质素移除率由7.9%增至51.2%，去除效果良好，木质素移除率在石灰用量为0.15～0.25 g·g-1间无显著差异（P＞0.05）；当石灰用量为0.05～0.10 g·g-1时，半纤维素移除率由18.1%增至37.8%，半纤维素移除率在石灰用量为0.10～0.25 g·g-1间无显著差异（P＞0.05）.纤维素移除率在石灰用量为0.05～0.10 g·g-1时显著提高，但随后变化不大，最高仅为6.3%（图4）.综合以上结果和从节约成本角度出发，采用石灰用量为0.15 g·g-1进行其他单因素试验.

图4 预处理原料的石灰用量对‘热研4号’王草化学组分的影响Fig.4 Effects of the lime dosage of material on the chemical composition of‘Reyan No.4’

2.3 正交试验

根据以上单因素试验结果，选取对木质素去除影响较明显的时间、温度、固液比和石灰用量作为研究对象，设计L9（34）正交试验，并对总酶解得率进行极差分析，结果如表3所示.4个因素对总酶解率影响的主次顺序为A＞B＞D＞C，即时间＞温度＞石灰用量＞固液比，其中：时间和温度是主要因素，其次是石灰用量和固液比；且最优预处理组合为A1B3C1D2，即时间3 h、温度125℃、固液比（m∶V）1∶12（g·mL-1）、原料的石灰用量为0.15 g·g-1.试验4的木质素移除率较高，但半纤维素移除率较低，所以总酶解得率较低.试验3、5、8的木质素移除率和总酶解得率均较高，可见，木质素的位阻效应及木质素与纤维素竞争吸附酶会导致纤维素酶的水解效率降低.所以，木质素的移除对酶解有较大的促进作用，木质素移除越多，酶与底物越容易发生接触，使之酶解，纤维素和半纤维素更易转化为葡萄糖和木糖.

2.4 预处理最终效果比较

对最优条件下预处理和未经处理的‘热研4号’王草进行酶解，结果显示其预处理前后的化学组分和酶解得率均存在极显著差异（P＜0.01）（表4）.预处理后，‘热研4号’王草干质量降低了近30%；木质素和半纤维素质量分数极显著降低，纤维素移除较少，其移除率分别为65.4%、37.5%、6.1%.预处理后，半纤维素、纤维素和总的酶解得率分别提高了18.1、4.5和4.4倍.可见，‘热研4号’王草经石灰预处理可显著提高酶解效率，其中半纤维素的酶解效果最为明显.

表3 ‘热研4号’王草石灰预处理正交试验及酶解结果1）Tab.3 The results of lime pretreatment orthogonal test and the follow ing enzymatic hydrolysis of‘Reyan No.4’

表4 ‘热研4号’王草预处理前后组分和酶解效果比较1）Tab.4 The com position and enzymatic hydrolysis of pretreated and untreated‘Reyan No.4’

3 讨论与结论

本试验研究了石灰预处理中4个因素对‘热研4号’王草总酶解得率的影响，其影响大小为：时间 ＞温度＞石灰用量＞固液比.该结果与Chang等［16］研究石灰预处理影响杨树酶解得率因素的结果一致，且时间和温度是主要因素，其次是石灰用量和固液比.

Karr等［13］使用石灰对玉米秸秆进行了预处理，在固液比（m∶V）1∶5（g·mL-1）、原料的石灰用量0.075 g·g-1、120℃条件下处理4 h，其酶解得率提高了9倍.陈明［25］使用与Karr等［13］相同的石灰预处理条件处理玉米秸秆，结果其木质素、半纤维素的脱除率分别为38.4%、14.8%，纤维残渣48 h后的酶解得率为52.9%.Kim等［26］使用超临界CO2预处理白杨和南方松，以提高纤维素酶水解效率，结果显示：在165℃、21 MPa条件下预处理30 min后，白杨和南方松还原糖产量可分别达理论值的84.7%和27.3%.本试验中，‘热研4号’王草经石灰预处理后，木质素、半纤维素和纤维素移除率分别为65.4%、37.5%和6.1%，半纤维素、纤维素和总酶解得率分别提高了18.1、4.5和4.4倍.这与陈明［25］、Karr等［13］的研究结果较相似，石灰预处理均可脱除木质素和半纤维素，提高酶解得率.所以，‘热研4号’王草经石灰预处理可显著提高酶解效率，其中半纤维素酶解效果最为明显.

‘热研4号’王草是生产燃料乙醇的优良能源植物，其纤维含量较高，利用石灰预处理可有效去除木质素，提高纤维素酶对原料组分的可及度.最优预处理条件为：时间3 h，温度125℃，固液比（m∶V）1∶12（g·mL-1），原料的石灰用量0.15 g·g-1.此条件下‘热研4号’王草的木质素、半纤维素和纤维素移除率分别为65.4%、37.5%和6.1%；半纤维素、纤维素和总纤维原料的酶解得率分别为43.5%、85.7%和55.2%，比未处理的‘热研4号’王草酶解得率分别提高了18.1、4.5和4.4倍.此外，影响酶解得率的主要因素是预处理时间和温度，其次是石灰用量和固液比.

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【责任编辑李晓卉】

Lime pretreatment optim ization of Pennisetum purpureum× P.americanum cv.Reyan No.4 for ethanol production

GAO Ruifang，ZHANG Tengfei，ZHANG Jianguo
（College of Agriculture，South China Agricultural University／Key Laboratory of Energy Plant Resources and Utilization，Ministry of Agriculture，P.R.China，Guangzhou 510642，China）

【Objective】The pretreatment ofPennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4 was studied with lime to improve the conversion rate for ethanol production.【Method】The effects of pretreatment time，temperature，the lime dosage，and solid-to-liquid ratio aswell as the orthogonal optimization test on the composition and the following enzymatic hydrolysis of‘Reyan No.4’were investigated.【Result and conclusion】The optimal pretreatment conditionswere as follows：pretreatment time 3 h，temperature 125℃，solid-to-liquid ratio 1∶12（g·mL-1）and the lime dosage ofmaterial0.15 g·g-1.Under the optimal condition，drymass losswas 28.1%in lime pretreatment，and the removal rates of lignin，hemicellulose and cellulose were 65.4%，37.5%，6.1%，respectively.The yields of hemicellulose，cellulose and total residue were 45.5%，85.7%，55.2%，respectively；in the following enzymatic hydrolysis，they increased 18.1 times，4.5 times and 4.4 times，respectively，compared with those of untreated‘Reyan No.4’.The primary factors influencing enzymatic hydrolysis yield were temperature and time，followed by lime dosage and solid-to-liquid ratio.

Pennisetumpurpureum×P.americanumcv.Reyan No.4；lime；pretreatment；ethanol production

TQ353.42

A

1001-411X（2014）04-0103-06

2013-12-18优先出版时间：2014-06-03

优先出版网址：http:∥www.cnki.net／kcms／doi／10.7671／j.issn.1001-411X.2014.04.019.html

高瑞芳（1987—），女，硕士，E-mail:740753128＠qq.com；通信作者:张建国（1968—），男，教授，博士，E-mail: zhangjg＠scau.edu.cn

“十二五”国家科技支撑计划（2011BAD17B02-05）

高瑞芳，张腾飞，张建国.用于乙醇生产的‘热研4号’王草石灰预处理条件优化研究［J］.华南农业大学学报，2014，35（4）：103-108.