间充质干细胞来源膜微囊转运蛋白减轻心肌缺血再灌注损伤的研究进展

洪勉名综述，陈建英审校（广东医学院附属医院心内科，广东湛江524000）

间充质干细胞来源膜微囊转运蛋白减轻心肌缺血再灌注损伤的研究进展

洪勉名综述，陈建英审校（广东医学院附属医院心内科，广东湛江524000）

间质干细胞；细胞质膜微囊蛋白；心肌缺血；心肌再灌注损伤；综述

缺血性心脏病是一类严重危害人类健康的疾病，尤其是心肌梗死发生后，心肌细胞数量减少，梗死区纤维组织增生，逐渐发生退行性左心室重塑，心功能下降，最终导致充血性心力衰竭。传统药物、搭桥手术、导管介入治疗等血运重建在一定程度上改善了心肌缺血的症状，使心肌梗死患者的生存率有所提高。然而恢复血流灌注后出现心肌功能障碍和结构损害，表现为致死性再灌注损伤、心肌顿抑、心律失常和能量代谢的改变，称之为心肌缺血再灌注损伤（IRI）[1]，即MI/R。近年来，IRI成为患者从缺血后复流获益的主要障碍。其机制复杂，目前认为与再灌注后细胞内Ca2+超载、氧自由基大量生成、微血管内皮细胞损伤及血管内皮细胞与白细胞/血小板之间相互作用等[2]。目前，临床上治疗心肌IRI的主要药物有自由基清除剂、血管紧张素转换酶抑制剂、Ca2+拮抗剂等，但效果皆不理想。间充质干细胞（MSC）治疗心肌梗死近年来受到广泛关注，并已获得部分结果，令人鼓舞，有望弥补目前药物治疗、介入治疗以及手术治疗的不足，成为缺血性心脏病的治疗策略之一。

1 MSC通过膜微囊（MVs）作用保护心脏

MSC是一种存在于骨髓、脂肪、肌肉等胚内组织以及胎盘和脐带等胚外组织的未分化多能细胞，在不同的诱导条件下可以分化为不同组织，具有自我更新的能力，MSC来源方便，易于分离、培养、扩增，不存在免疫排斥，是目前较为理想的治疗用干细胞[3]。体内MSC主要存在于骨内膜和微血管外膜，构成血管周围微环境，对其他细胞起着支持作用，在连接组织和骨组织的形成、结构稳定方面发挥作用。MSC在体外培养过程中，形态、表型或是分化潜能上都不是均一的，主要由祖细胞和成熟细胞组成，培养后MSC植入能力下降，体内存活能力减低，现更趋于命名为间充质基质[4]。MSC移植后在短时间内大量死亡，心肌内直接注射，存活率仅为2%～5%，在缺血区存活的少量MSC产生了非常可观的治疗效果，使梗死心肌面积缩小。这不可能是移植细胞转分化为心肌细胞的再生作用，更可能的机制是MSC的旁分泌作用，许多研究证实，MSC能分泌多种细胞因子、生长因子、趋化因子，MSC的条件培养基能起到与MSC移植类似的功能效应[5]。Angoulvant等[6]在猪和小鼠的心肌IRI模型中，静脉注射MSC条件培养基，在短短4 h内，MSC条件培养基能减少MI/R 50%～60%，心功能显著改善。Lai等[7]对培养上清做分子量分馏法分析，发现其对心肌作用有效成分大于1 000×103，提示上清液中分泌物的大分子群体而非小分子蛋白起作用。通过超速离心分离出这些颗粒同样能够减轻小鼠心肌IRI模型的梗死面积。通过电镜观察和流式细胞技术鉴定这些具有膜磷脂包裹的颗粒正是来源于MSC的MVs。

许多细胞包括MSC在静息或缺氧应激、凋亡、剪切力等因素刺激下会以“出孢”的形式从细胞膜释放MVs，MVs是一种大小为0.1～1.0滋m且具有双层磷脂结构的囊泡，最近的研究提示，MVs主要是作为一种细胞间生物信号和信息交换的载体，MVs的各种组分，包括膜表面受体、生物活性脂类，内含的各种细胞因子、趋化因子、生长因子等蛋白质及mRNA、miRNA均可以发生转移，导入其他细胞内[8]。来源于MSC的MVs已被证实具有明确的组织再生修复作用以及潜在的免疫调节、调控细胞生长分化等功能，Huang等[9]认为，MSC改善损伤修复的机制大部分来源于其分泌的MVs作用。Kim等[10]通过质谱分析发现了730种MSC来源的MVs蛋白。对这些蛋白进行功能分析表明这些蛋白涉及细胞增殖、黏附、迁移和形态发生。

2 MVs通过转运蛋白质减轻IRI

Li等[11]通过分析心肌IRI蛋白组学改变发现，多种蛋白质大量减少，这些蛋白大部分是作用于脂肪酸氧化、糖酵解、三羧酸循环等过程的关键酶。这些能量生成关键酶缺失进一步加剧IRI起始由于缺氧导致的能量生成障碍。再灌注心肌另一个蛋白组学显著改变是促凋亡蛋白的增加，细胞凋亡被认为是引起急性心肌梗死的主要因素之一，阻断凋亡信号通路能够减轻IRI。蛋白组学的改变在再灌注损伤后至少持续60 min，在这个时间窗内通过补偿蛋白质学的改变或许可以逆转细胞的损伤。MVs是具有磷脂膜结构的微囊泡，目前普遍认为其通过传递其包含的物质发挥作用，由于MVs其磷脂膜结构特殊性，在IRI中能够保护其内含蛋白质的稳定性，不受周围改变的环境影响，通过其磷脂结构发生膜融合或胞吞作用或者吞噬作用进入心肌细胞，其含蛋白质部分是酶类，酶催化具有高效性，能够放大其效应[12]，虽然MVs包含蛋白质和RNA，但在IRI中发挥主要作用的更倾向于蛋白质，不像RNA发挥作用需要过程相对较长且消耗ATP的基因转录，进入内皮细胞的蛋白质能够即时迅速发挥作用[13]。

2.1 改善能量代谢MVs包含了多种糖酵解相关的蛋白，如3-磷酸甘油醛脱氢酶、蛋白激酶G、M2型丙酮酸激酶等，如前述IRI时这些酶缺失，MVs通过补充这些关键酶，提高糖酵解通量和腺苷三磷酸（ATP）产量，IRI时从有氧代谢到无氧代谢的转变对保护心肌非常关键，虽然有氧氧化1分子的葡萄糖产生38个ATP，无氧酵解产生2个ATP，但是同样的时间内，无氧酵解相比有氧氧化1 min内能够产生3倍多的ATP，这短暂而快速产生的ATP能够及时为早期缺血心肌提供启动修复程序的能量[14]。ATP明显下降可进一步引起一系列代谢异常和紊乱，细胞膜、肌浆网Ca2+-ATP酶活力及肌浆网钙摄取能力下降，使Ca2+内流增加并激活膜磷酶，使膜磷脂降解为溶血磷脂，导致缺血性肌挛缩，在此过程中产生氧自由基进一步产生损害作用；依赖ATP的细胞膜泵活性降低，膜电位改变及心电图ST段改变。能量代谢障碍可造成心肌细胞基因结构及表达的异常，细胞内的ATP水平是决定细胞发生凋亡或坏死的主要因素。MVs通过提供糖酵解的关键酶提升ATP产量有助于恢复离子稳态，是其对细胞损伤保护机制之一。另外糖酵解的增强产生的中间产物为合成代谢所需要，从而支持细胞的生存和修复。实验证明，经微囊处理的小鼠IRI心肌ATP产量增加以及心肌梗死面积减少[15]。

2.2 抑制细胞凋亡MI/R的发生与细胞凋亡密切相关，细胞凋亡是IRI的特征性改变，细胞凋亡的多少决定着IRI的轻重。研究显示，抑制心肌细胞凋亡，可以减轻心肌IRI[16]。抗凋亡的一些蛋白激酶如AKT、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）的激活被证实在IRI时对心肌有保护作用。AKT、ERK1/2归属于体内两条最重要的存活信号通路即Ras/Raf/MEK/ERK（MAPK）和PTEN/PI3K/ AKT/mTORMVs，这些通路的激活对于组织修复和损伤的减轻，包括MI/R具有重要作用，MVs表达MSC特异性抗原CD73，具有MSC部分功能，CD73[17]是目前最可能的参与抗凋亡的蛋白，是目前已知唯一能够水解细胞外腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）为腺苷的5-核苷酸酶，腺苷通过磷酸化激活ERK和AKT信号通路，维护细胞的生存，动物实验和临床实验均已经证实能够减轻IRI[18]，MI/R时，ATP和腺苷二磷酸被释放到细胞外间隙，并且很快被降解为AMP，AMP正是CD73作用的底物。

2.3 抑制补体介导的细胞损伤补体系统是血清及体液中的一组具有酶活性的蛋白质。补体系统在IRI通过多种途径被激活，形成大量的活化片段。许多证据均表明，补体系统的激活在IRI中发挥着重要作用[19]，其通过直接作用和对白细胞与内皮细胞的间接作用造成组织器官损伤。损伤机制包括：补体激活后最终生成攻膜复合体（MAC），MAC嵌入细胞膜内形成贯通胞膜的圆形孔道，引起水、钠和钙离子内流，造成细胞肿胀和钙超负，从而崩解死亡；同时MAC和C5a还可诱导p21（ras）表达引起细胞凋亡；CD59是一个广泛表达的糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白，可以结合MAC上的C8和C9，干扰MAC嵌入和圆形孔道形成，从而抑制MAC介导的细胞裂解，MVs含有CD59分子，通过抑制补体介导的细胞损伤，可能是IRI时MVs对心肌保护机制之一[20]。

3 展望

MSC作为一种细胞治疗已经进入临床Ⅱ期试验阶段，但临床应用尚存在静脉滴注可致心律失常、毛细血管床阻塞，在体内进行成骨、成软骨方向分化，以及宿主排异、肿瘤形成风险等安全隐患[21]。MVs具有MSC的修复作用，同时具有选择性组装、靶向性投递、保存稳定等特点，能远距离、长时程、多靶点的高效作用于相应组织，有希望成为一种既具有MSC作用特点而又能规避其缺陷的新型治疗缺血性心脏病的手段[22]，MVs作为独特的胞外细胞器，内含种类丰富的蛋白质，通过转运蛋白质可以对心肌起保护作用。目前，人们对MVs作用机制的认识还不够全面，如MVs具体的生物活性成分、调节MVs内生物活性分子聚集、释放的信号通路以及MVs表面配体的特异性结合等问题有待于更多的研究来阐明。

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A

1009-5519（2014）12-1807-03

2014-01-30）

广东省湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目（2011D0302）。

洪勉名（1987-），男，广东海丰人，硕士研究生，主要从事间充质干细胞与冠心病治疗研究；E-mail：kyless@126.com。