兔腹主动脉粥样斑块的建立与超声评价＊

张 勇，陆永萍，周 虹，袁 媛，汤跃跃，刘 蕊，李云燕，徐丽荣

（昆明医科大学第四附属医院／云南省第二人民医院超声科，昆明650021）

动脉粥样硬化是目前人类主要的健康问题之一，饮食结构及生活习惯的改变是动脉粥样硬化的主要原因，其患病率呈上升的趋势［1］。动脉粥样硬化是引起多种心脑血管疾病的病理生理基础，随着动脉粥样硬化发生机制和预防、治疗方面研究的不断深入，迫切需要建立一种简便易行、重复性好、有较典型病理改变、易于评价且适于干预治疗的动物模型。本研究选择高脂饲料喂养的方法建立兔腹主动脉粥样斑块模型，用二维超声及病理观察、评价兔腹主动脉粥样斑块情况。用高频超声评价兔腹主动脉粥样斑块形成的过程及情况，从而探讨兔腹主动脉粥样斑块模型制备的方法［2］。

1 材料与方法

1.1 兔腹主动脉粥样斑块模型的建立 选取雄性日本大耳白兔80 只，体质量2.0～2.5 kg，由昆明医科大学实验动物科提供。60 只兔给予高脂饲料饲养（配方为：1%胆固醇，7.5%蛋黄粉，8%牛油，83.5%常规饲料），自由饮水，喂养12 周后，开始对兔的腹主动脉进行超声观察，每2 周观察1 次，发现斑块后，详细进行超声检查及记录，处死动物，进行病理检查［3］。另选取20 只兔常规喂养，喂养12 周后，超声观察并陆续处死动物，约每2 周处死动物4 只，并进行病理切片观察。

1.2 兔腹主动脉粥样斑块模型的超声评价 将兔子仰卧固定于操作台上，胸腹区脱毛，静脉留置针于耳缘静脉建立静脉通道，向静脉内推注3%戊巴比妥钠麻醉，剂量为1 mL／kg。麻醉成功后使用Philip iE 33 超声诊断仪，L9-3 高频探头自剑下扫查，获得腹主动脉稳定图像，并观察兔腹主动脉内膜及斑块情况。在腹主动脉开口2 cm处避开斑块，测量腹主动脉内中膜复合体的厚度；沿兔腹主动脉长轴切面扫查，后又取横断切面，沿长轴方向扫查，发现斑块后，仔细观察斑块的回声、大小、形态，对斑块的性质作出评价［4］。

1.3 病理切片观察 超声观察后处死动物，截取腹主动脉，肉眼大体观察。用10% 的中性甲醛溶液固定，然后用HE染色方法制备成病理切片，在显微镜下观察。

2 结 果

2.1 超声观察 模型组喂养过程中死亡6 只兔，培养成活54只。52 只动物在12～20 周不等的喂养周期内通过超声观察发现了腹主动脉粥样斑块（图1、2），有2 只兔在饲养观察过程中始终未发现斑块（表1）。正常组（正常喂养的兔）喂养过程中有1 只死亡，成活19 只。观察过程中对其腹主动脉内中膜复合体厚度进行测量，并与模型组比较（表2）。模型组54 只兔12 周 出 现 斑 块15例，软 斑13例，硬 斑2例；14周 增 加17例，共计32例，软斑26例，硬斑6例；16 周增加15例，共计47例，软斑38例，硬斑9例；18 周增加3例，共计50例，软斑38例，硬斑10例；20 周增加2例，共52例。20 周后，所有斑块中软斑41例，硬斑11例。软斑回声显示为中低回声，硬斑的回声增强。

表1 模型组腹主动脉粥样斑块形成过程［n（%）］

表2 两组兔主动脉内中膜复合体厚度比较（±s，mm）

表2 两组兔主动脉内中膜复合体厚度比较（±s，mm）

＊：P＜0.05，与正常组比较。

组别 n 12 周 14 周 16 周 18 周 20 周正常组 190.8±0.140.8±0.190.9±0.230.9±0.190.9±0.22模型组 540.9±0.14＊ 1.0±0.18＊ 1.1±0.23＊ 1.2±0.19＊ 1.2±0.24＊

正常组所有兔在超声观察过程中未见明显斑块，12、14、16、18 周模型组腹主动脉内中膜复合体均高于同时期正常兔主动脉内中膜复合体厚度（P＜0.05）。见图1、2。

图1 二维超声观察兔腹主动脉粥样斑块

图2 彩色血流显示斑块处血流充盈缺损

2.2 病理观察52例制备成功的模型，均经病理切片证实，在腹主动脉相应部位均有斑块形成，超声检查符合率100%。常规喂养组兔腹主动脉柔软有弹性。高脂饲料饲养组腹主动脉至髂动脉分叉处内膜欠光滑，部分中断，内膜不均匀增厚，有浅黄色条纹发生，多处不光滑，呈凹凸不平的黄色斑块形成，管壁僵硬。

显微镜下观察：内膜明显增厚，其下至中膜深层均有大量泡沫细胞构成斑块，中膜平滑肌细胞增殖，排列紊乱，为粥样斑块形成。52例斑块病理证实软斑42例，符合率97.6%，病理特征为内皮细胞呈长椭圆形，核裸露，胞质中可见大量泡沫细胞，线粒体肿胀、粗面内质网扩张，细胞周围可见大量胶原纤维；硬斑10例，符合率100%，病理特征为含丰富胶原的基质及粥样斑块［5］（图3）。

图3 兔腹主动脉斑块病理图片HE 染色（图左×40，图右×100）

3 讨 论

本研究对以往喂养模型和观察方法加以改进，设计出科学合理的喂养方法，采用专门配方喂养。高脂喂养12 周后，超声观察便可发现兔腹主动脉陆续有粥样斑块形成，到了16～20周后斑块培养基本成功，成功率达96%，模型兔腹主动脉均可见粥样斑块形成，本方法兔腹主动脉粥样斑块模型建立成功。培养过程中以软斑形成为主，随着病程的延长，软斑逐渐变为硬斑。

通过二维超声检查发现：52 只模型兔腹主动脉可见粥样斑块形成。其余2只模型兔腹主动脉始终未发现明显斑块。分析原因可能是：因高脂饲料喂养突然改变饮食结构，在喂养过程中部分模型兔出现明显腹泻，高脂饲料摄入不足，吸收减少。

本研究发现模型制备过程中早期软斑出现较多，后期硬斑发生率稍增加，但始终以软斑为主。直到兔饲养到20 周前后其软斑41例，发生率为79%。其原因可能为：（1）兔本身代谢方式的影响；（2）早期斑块仍处于新鲜、才形成过程中；（3）没有采取干预措施，减轻斑块炎性反应及血管生成，斑块未固定［5-6］。

本研究中所有超声确定有斑块者后经病理切片均证实其相应部位有粥样斑块形成，二维超声根据斑块的回声来确定斑块的性质：一般认为中低回声为软斑，高回声及强回声以硬斑为主。经病理证实其性质基本符合，说明超声可准确评价动脉粥样斑块的形成及类型，在动物模型制备过程中可作为一种无创简便的监测工具，超声的影像可以作为评价动物模型制备成功与否、周期控制、喂养方案调整的依据。

本研究保守地从12 周后开始观察，每两周动态观察1 次至20 周。已经发现有15例兔发生了粥样斑块，但何时最早出现，何种状态出现较早，没有记录到，因此认为可将其观察周期提前，探索出最佳的喂养及观察方案。

动脉粥样斑块动物模型的建立成为动脉粥样硬化研究中不可替代的工具。因动物本身的生理特点，现有的模型不可能完全地复制出人类动脉粥样硬化的变化和病理过程。家兔的动脉粥样硬化模型只能在一定程度上代表人类动脉粥样硬化的病变。由兔的病理形态学研究中可知，兔的斑块形态与人类斑块的早期病变相接近，更适合做AS 发生早期机制的研究；加强对临床AS 发病机制的研究，结合临床发病机制及病变特点，建立更加符合人类AS 特点的动物模型对AS 的诊断、治疗及预防具有重大的意义［7］。

［1］ Moulton KS.Plaque angiogenesis and atherosclerosis［J］.Curr Atheroscler Rep，2011，3（3）：225-233.

［2］ Tang YY，Xie YC，Huang YL，et al.Contrast-enhanced ultrasound in assessing atherosclerosis of abdomind aorta in rabbits model：a preliminary study［J］.J Kunming Medical College，2010，31（12）：12-15.

［3］ Tsimikas S，Shaw PX.Non-invasive imaging of vulnerable plaques by molecular targeting of oxidized LDL with tagged oxidation-specific antibodies［J］.J Cell Biochem Suppl，2002（39）：138-146.

［4］ Moulton KS，Olsen BR，Sonn S，et al.Loss of collagen XⅧI enhances neovascularization and vascular permeability in atherosclerosis［J］.Circulation，2004，110（10）：1330-1336.

［5］ Hamilton AJ，Huang SL，Warnick D，et al.Intravascular ultrasound molecular imaging of atheroma components in vivo［J］.J Am Coll Cardiol，2004，43（3）：453-460.

［6］ Abdolreza Rezaie-Majd，Maca T，Robert A，et al.Simvastatin reduces expression of cytokines interleukin-6 interleukin-8，and monocyte chemoattractant protein-in circulating monocytes from hypercholesterolemic patients［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22（7）：1194-1199.

［7］ Yao CX，Yang B.Research and application of targeting microbubble contrast agent in ultrasonic diagnosis and treatment［J］.Chinese Journal of Ultrasonography，2009，18（1）：83-85.