线粒体通路与心肌缺血再灌注损伤

赵志芳 综述 崔炜 审校

(1.河北医科大学第二医院心血管病研究所心血管内科，河北石家庄 050000;2.河北医科大学第三医院呼吸内科，河北石家庄 050000)

缺血性心脏病已成为一个全球性的健康问题，在我国的发病率呈逐年上升趋势，已成为当今世界威胁人类生命健康的主要原因之一。因此，尽快恢复缺血区血液供应是解决缺血性心脏病的根本。随着经皮冠状动脉介入治疗术、溶栓治疗及冠状动脉旁路搭桥术等的广泛应用，使缺血性心脏病的临床转归大大改善，但是同时，有一部分病人在缺血心肌恢复血液供应的过程中出现了心力衰竭，甚至死亡。这种在恢复缺血区血流过程中心肌损伤加重并进一步造成心功能障碍的现象称之为心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。在1960 年，Jennings等[1]第一次在犬的冠状动脉结扎试验中，观察到心肌I/R损伤的现象，并指出心肌缺血性损伤不但发生在缺血当时，更主要是发生在恢复缺血区血液供应之后。再灌注损伤主要包括心律失常、心肌顿抑、微血管损害、无复流和炎症反应。心肌缺血往往伴随严重缺氧、酸中毒、能量耗竭和离子动态平衡紊乱，导致心肌功能障碍，最终心肌细胞死亡。在心肌细胞中，线粒体含量丰富，并且是能量的主要来源地。所以，不难理解线粒体在I/R损伤中发挥着重要的作用，已逐渐成为心肌保护信号转导通路的终末效应器。许多研究已经证实线粒体是心脏保护的重要靶器官[2-3]。在I/R损伤中，线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATPchannels)和线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)发挥着关键作用。

1 mitoKATP通道

1.1 mitoKATP通道与心肌保护

MitoKATP通道的生理学作用主要是以下两方面:(1)通过将K+摄取入线粒体，补偿由质子泵引起的电荷变化，从而维持pH梯度和线粒体膜电位的稳态;(2)通过调节K+摄取，维持线粒体内的离体平衡，控制线粒体容积的改变。MitoKATP通道的开放，使K+内流，膜轻度去极化，降低Ca2+内流的驱动力，减轻线粒体内钙超载。同时基质容积的改变能够激活脂肪酸氧化和电子转移，促进能量物质ATP的合成作用。二氮嗪(diazoxide)可以有效活化mitoKATP通道，5-羟葵酸(5-hydroxydecanoic acid，5-HD)通过阻断 mitoKATP通道取消二氮嗪的心肌保护作用[4]。尼可地尔选择性的开放mitoKATP通道，可以有效地减少缺血再灌注后心律失常的发生和心肌酶标志物的水平[5]。

1.2 mitoKATP通道与氧化应激

在正常新陈代谢中，往往伴随着自由基的产生，少量的自由基是维持生命活动所必需的，但是如果产生的量过高时，就会对机体产生致命性的损害作用。由于机体受到应激等因素，组织胞浆和线粒体内的促氧化酶的作用，抗氧化物再生作用失活及抗氧化物消耗等促使自由基产生清除平衡受到破坏，进而产生过量的氧自由基。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是由氧直接或间接转变而成的氧自由基及衍生物。ROS的浓度超过正常生理极限时就会破坏组织细胞，引发脂质过氧化反应，进一步破坏细胞膜及亚细胞器，最终导致细胞损伤[3]。

在心肌I/R损伤的发病机制中，ROS起着双重作用。实验证明在心肌保护中，少量的ROS的产生发挥重要作用。二氮嗪(diazoxide)，mitoKATP通道的开放剂，能够增加鼠心肌细胞内ROS的产物[6]，并且二氮嗪可以减少I/R后心肌梗死面积，但是抗氧化剂MPG可以阻断二氮嗪的心肌保护效果[7]，说明mitoKATP通道通过促进少量的ROS产生发挥心肌保护作用，但是大量的ROS产生会导致心肌损伤。缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)能够减少I/R后ROS的大量产生，并且还发现二氮嗪可以减少I/R后大量ROS 的产物[8]。Thuc 等[9]发现普伐他汀预处理对ROS的产物具有双重效果，普伐他汀可以引起ROS的适度增加，随后抑制H2O2导致的ROS大量爆发。综上发现mitoKATP通道的开放可以促使少量的ROS产生，同时又能抑制I/R后的ROS大量爆发，减轻I/R损伤。

1.3 mitoKATP通道与钙超载

钙超载是诱导心肌细胞死亡的主要原因之一。心肌细胞通过多种钙转运机制，调节细胞内及线粒体内的钙离子(Ca2+)浓度。I/R后，ATP减少，胞膜和肌浆网钙泵发生功能障碍，使细胞内Ca2+浓度增加;另外，I/R后细胞内pH值降低，激活Na+-H+交换体，使细胞内Na+浓度增高，进而激活Na+-Ca2+交换体，排出Na+，使Ca2+内流，当细胞内Ca2+浓度增加时，磷脂酶激活，水解膜磷脂，破坏膜结构的完整性。同时，线粒体的钙转运体将细胞内的钙运输到线粒体内，使线粒体内钙超载。诱发线粒体结构破坏和功能障碍，最终导致细胞死亡。MitoKATP通道的开放可促使K+内流进入线粒体，从而使线粒体跨膜电位发生变化，减少了Ca2+内流的动力，减少线粒体内钙超载[10]。二氮嗪可以减少I/R后钙超载，mitoKATP通道的活化可以加快呼吸链的电子传递，促进氧化磷酸化，使ATP合成增加，保护线粒体的结构和功能，减轻I/R后心肌损伤。上述效果被mitoKATP通道的阻断剂5-HD取消[10]。

1.4 mitoKATP通道的检测

检测mitoKATP通道的方法如下:(1)电生理学记录是证实 mitoKATP通道存在的最确切的证据。Inoue等[11]从肝脏细胞上提取线粒体，通过膜片钳直接测定线粒体上的K+电流，其可被0.8 mmol/L的ATP抑制，从而证实了mitoKATP通道的存在。(2)测定由纯化线粒体片段重建的蛋白脂质体对K+的摄取。这种方法已经被Garlid和他的同事们广泛地使用[12]。(3)在520 nm处，测定光密度直径而判断线粒体的基质容积[4]。因为mitoKATP通道开放，K+内流，伴随着渗透性离子和水的进入，暂时性地超过K+/H+交换能力，结果可导致线粒体基质容积增加。(4)测定黄素蛋白自发荧光评估线粒体氧化还原状态。一系列的研究[13-14]通过测定黄素蛋白自发荧光评估mitoKATP的开放情况。mitoKATP通道的开放导致氧化磷酸化的适度解耦联，表现为黄素蛋白的荧光增加。(5)Northern印迹法与RT-PCR方法测定kir6.1 mRNA和SUR1 mRNA的表达水平[15-16]。(6)蛋白质印迹(western blot)技术被用来测定mitoKATP通道亚单位的蛋白表达水平[15]。

2 线粒体通透性转换孔

2.1 线粒体通透性转换孔与心肌保护

由于细胞环境的不同，mPTP通常有以下三种状态:(1)生理情况下的关闭状态;(2)低通透性开放状态，可使线粒体内Ca2+释放，减轻线粒体内钙超载;(3)高通透性开放状态，可使分子量＜1.5 kD(≈1.5×103)的溶质分子通过线粒体膜，导致线粒体内水肿，呼吸链和氧化磷酸化失耦联，ATP合成受阻，线粒体膜电位下降，细胞色素C等前凋亡蛋白释放[17]。所有促进mPTP开放的因素都可以被mPTP生理性拮抗剂阻断，例如腺嘌呤核苷酸、质子的浓度增加，线粒体膜电位的超极化和镁离子等[18]。mPTP的开放也能被一些药物阻断，如环孢素 A(cyclosporine A，CsA)[19]。抑制mPTP的开放可减轻I/R后的损伤程度。环孢素A能减少缺氧复氧后乳酸脱氢酶(LDH)的释放，增加ATP的含量，上述效果可被mPTP的开放剂苍术苷(atractyloside)取消[20]。普伐他汀可明显改善缺氧复氧后心肌细胞的收缩力，发挥心肌保护作用，mPTP的开放剂苍术苷抑制了普伐他汀的作用[21]。Onishi等[22]在七氟醚预处理研究中，证实七氟醚通过增加mPTP开放的阈值发挥心肌保护作用。尼可地尔也可以抑制I/R造成的线粒体通透性转变，从而发挥保护心肌的作用[23]。

多项研究表明，mPTP在心肌I/R损伤中发挥着重要的作用。高pH值、ATP耗竭、高磷酸盐、钙超载、ROS的爆发等因素均可诱发mPTP的开放[24]。其中钙超载和ROS是mPTP开放的主要诱发因素。

2.2 mPTP与氧化应激

线粒体是氧自由基产生的主要场所。生理情况下，生物体内存在抗氧化剂与抗氧化酶系统，能够及时清除氧自由基。但当心肌发生I/R时，氧自由基生成系统增强，内源性氧自由清除系统功能下降，使氧自由基大量产生。氧自由基在体内发生连锁反应产生的高活性的氧化还原中间产物统称为ROS。其可作用于ANT的硫醇，促进其氧化，进而诱导mPTP的持久开放，最终导致细胞功能障碍及细胞死亡[25]。心肌细胞内可能存在ROS诱导ROS释放(ROS-induced ROS release，RIRR)。事实上，mPTP在ROS诱导ROS释放中发挥重要作用，过多的ROS诱发mPTP的开放，由于mPTP的开放导致的细胞色素C及吡啶核苷酸的丢失抑制呼吸链，进而促进ROS的产生[26]，从而加重心肌细胞损伤。

2.3 mPTP与钙超载

细胞外的Ca2+通过肌膜和横管膜上的L型钙通道进入胞浆，触发肌浆网终池大量释放贮存的Ca2+，使胞浆内Ca2+浓度升高而引起心肌收缩。心肌收缩结束时，肌浆网膜上的钙泵逆浓度差将胞浆内的Ca2+主动泵回肌浆网，同时肌膜可以通过钠钙交换和钙泵将Ca2+排除胞外，使胞浆Ca2+浓度下降。在心肌I/R中，细胞内酸中毒，质子浓度明显高于胞外，激活钠氢交换体，使Na+进入胞浆，胞浆内的高Na+又使Na+Ca2+交换体激活，进而导致胞浆内Ca2+浓度增高。胞浆内的Ca2+可通过线粒体膜上的载体进入线粒体内。钙超载是诱发mPTP开放的重要因素之一[27]。VDAC表面有Ca2+的结合位点，游离的钙与mPTP的金属位点结合，促使mPTP开放。当线粒体内的钙浓度低于0.2 μm 时，mPTP失活;当高于 10 μm 时，诱导 mPTP的开放。心肌细胞发生缺血，缺氧或氧化应激时，ATP生成迅速减少，使细胞膜上离子泵功能下降，同时细胞外钙内流增加，导致细胞质内的钙超载，胞质中的钙顺着电化学梯度通过转运系统进入线粒体内，引起线粒体内钙超载，进而诱发mPTP的开放。

钙超载是I/R损伤的主要因素，减少钙超载可以阻断或者减轻心肌损伤。Ngoh等[28]研究发现O-Glc-NAcylation预处理明显减少缺氧或氧化应激引起的钙超载，进而抑制mPTP的开放，发挥心肌保护作用。

2.4 mPTP的检测

检测mPTP的方法主要有:(1)检测线粒体的肿胀程度。mPTP开放的同时伴随着线粒体的肿胀，并在520 nm处的吸光度减小[29]，通过测定线粒体肿胀程度间接反映mPTP的开放情况。(2)通过检测线粒体吸收Ca2+的能力反映mPTP的开放情况[29]。应用Ca2+敏感的荧光探针，当线粒体外的钙浓度增加时，Ca2+转运至线粒体内，线粒体内钙饱和，达到诱发mPTP的开放，Ca2+从线粒体内释放，线粒体外出现瞬间荧光强度增加，通过检测线粒体吸收Ca2+的能力，判断mPTP的易感性。(3)线粒体膜电位的测定，mPTP的开放，导致线粒体膜电位的下降，通过荧光标记的线粒体膜电位的变化，间接反映mPTP的开放情况[30]。(4)应用酯化钙黄绿素(calcein/AM)和氯化钴(CoCl2)共同孵育的方法进行mPTP开放程度的测定[31]。Calcein/AM能够通过活细胞膜扩散进入胞浆和线粒体，之后被非特异性酯酶催化生成不易透出细胞膜的水溶性绿色荧光物质calcein。加入的CoCl2不能进入线粒体，但是能进入细胞，并能与胞浆中的calcein结合，淬灭其荧光。所以当 mPTP未开放时，CoCl2能够猝灭胞浆中的calcein所发出的绿色荧光，但并不影响线粒体内的荧光强度。当mPTP开放时，线粒体内的calcein通过mPTP进入胞浆，从而被胞浆中的CoCl2所淬灭。通过用激光扫描共聚焦显微镜检测荧光强度的强弱，进而反映mPTP开放的程度。荧光强度的变化与mPTP的开放程度呈反比关系。(5)通过检测心肌组织内NAD+的含量反映mPTP的开放情况。线粒体内拥有组织中NAD+含量的90%以上。心肌I/R时，NAD+通过开放的mPTP被释放，进而被灌流液冲洗掉，因此，心肌组织中NAD+含量的高低能反映mPTP的开放情况，含量越低说明mPTP的开放程度越大，心肌损伤越严重[32]。(6)通过用3H-2-脱氧葡萄糖(3H-2-deoxygiucose，3H-DOG)预处理离体心脏，因为3H-DOG可在细胞质中磷酸化为3H-DOG-6-P，后者不能被转运至细胞外，也不能在细胞内进行代谢，当mPTP开放后，3H-DOG-6-P会通过mPTP进入线粒体。通过检测线粒体内的3H-DOG-6-P的含量，可评估mPTP的开放情况[30]。(7)细胞色素 C的检测。在正常情况下，细胞色素C存在于线粒体内外膜之间的腔隙中，mPTP的开放使细胞色素C从线粒体释放到胞质，应用免疫组化技术或免疫荧光技术可检测细胞色素C，间接反映mPTP的开放情况。

3 mitoKATP通道与mPTP的关系

Gao等[33]研究发现葛根素(0.24 mmol/L)预处理可以降低I/R后LDH的释放，改善血流动力学，减少线粒体的肿胀程度(通过检测线粒体的肿胀程度间接反映mPTP的开放程度)，mitoKATP通道的阻断剂5-HD取消了葛根素的上述效果，说明葛根素可能是通过mitoKATP通道的活化抑制mPTP的开放，进而发挥心肌保护作用。但是 mitoKATP通道的活化是如何抑制mPTP的开放的呢?研究发现mitoKATP通道的活化增加非缺氧条件下ROS的适度增加，降低再灌注后ROS的爆发，调节线粒体内K+平衡，促进Ca2+从线粒体释放到胞浆，降低Ca2+内流的驱动力，减轻线粒体钙超载，改善线粒体能量代谢[34]。ROS的爆发与钙超载激活mPTP的开放，抑制ROS的大量产生及钙超载，可以减少 mPTP的开放[28]。另外，mitoKATP通道的活化也可能通过蛋白激酶C epsilon(PKCε)的活化，进而抑制mPTP的开放[35]。当然，也许还有其他的信号途径需要进一步证实。

4 展望

线粒体的结构和功能的完整性对于心肌细胞的存活具有重要意义。心肌I/R使线粒体内的各种动态平衡受到破坏，各种因素相互影响，导致I/R损伤。随着研究的不断深入，有效的保护线粒体结构和功能的措施将成为防治心肌I/R的重要策略。

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