温州地区汉族人群CYP2C19和CYP2C9基因多态性分析

周怀彬，王金丹，胡理怀，温超玮，吕建新

（温州医科大学 检验医学院、生命科学学院，浙江省医学遗传学重点实验室，浙江 温州 325035）

温州地区汉族人群CYP2C19和CYP2C9基因多态性分析

周怀彬，王金丹，胡理怀，温超玮，吕建新

（温州医科大学 检验医学院、生命科学学院，浙江省医学遗传学重点实验室，浙江 温州 325035）

目的：研究温州地区汉族人群CYP2C19、CYP2C9基因多态性分布。方法：采用聚合酶链式反应和测序方法，对287例健康人群CYP2C19、CYP2C9基因多态性进行分析。结果：温州地区汉族人群的CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3三种等位基因的频率分别为65.16%、29.27%和5.57%；CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3基因型的频率分别为44.95%、33.45%、6.97%、4.18%、10.45%和0.00%，弱代谢率为14.63%；CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因频率分别为97.74%和2.26%，CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3的基因频率为95.47%和4.53%，未发现CYP2C9*3/*3。结论：温州地区汉族人群CYP2C19和CYP2C9弱代谢率与已报道的汉族人群基本一致，与日本人群相近，显著高于欧美人群。

P450；CYP2C19；CYP2C9；多态性；温州地区；汉族

细胞色素（cytochrome P450，CYP450）是一组参与生物转化的超基因家族编码的同工酶。其中CYP2C是细胞色素P450的主要成分，占其总量的20%。在CYP2C的亚家族中，CYP2C19和CYP2C9药物反应起着关键的作用。CYP2C19主要参与代谢的药物有：质子泵抑制剂、三环类抗抑郁药、抗癫痫药、抗精神病药、降糖药、抗凝药、抗疟疾药以及一些抗癌药物等。CYP2C9主要参与代谢的药物有香豆素类抗凝血药、血管紧张素II受体拮抗剂、口服降血糖药、抗癫痫药等。这两个基因酶活性在人群中呈多态性分布，而基因的多态性是导致这些酶活性个体差异的分子基础。我们利用测序方法对287例温州地区汉族人群CYP2C19和CYP2C9最主要的几个多态位点进行分析，计算各等位基因和代谢型的频率，为该地区的遗传多态性研究和临床合理用药提供参考。

1 对象和方法

1.1 研究对象 随机选取287例温州地区汉族健康体检人群，抽取2 mL静脉血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20 ℃保存待检。所有血样的采集均依据温州医科大学伦理委员会管理规定执行。

1.2 DNA提取 用宝生物工程（大连）有限公司Universal Genomic DNA Extraction Kit，按使用说明书进行操作提取DNA。

1.3 引物设计与合成 查阅文献，根据NCBI Gen-Bank数据库的序列，用Primer3在线设计引物（序列见表1）。引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 CYP2C19和CYP2C9引物序列

1.4 PCR扩增 50μL PCR体系包含100 ng基因组DNA，3μL 25 mmol/L MgCl2，5μL 2.5 mmol/L dNTP，5μL 10×buffer，20μmol/L引物各0.2μL，1 U Taq，用ddH2O补足50μL。95 ℃预变性5 min；94 ℃变性35 s，53～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃后延伸5 min，4 ℃保温。

1.5 DNA测序分型 对PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳观察，送上海鼎安生物科技有限公司进行测序（测序引物序列见表1）。

1.6 统计学处理方法 用SPSS19.0统计学软件进行统计学处理。根据基因型频率计算等位基因频率，采用x2检验分析基因型频率与Hardy-Weinberg平衡的符合程度，比较本组结果与其他文献公布的不同种族人群之间的差异。

2 结果

2.1 基因型的判定 CYP2C19*2和CYP2C19*3分别是681位点和636位点发生G→A突变。根据这两个位点的突变情况的不同组合呈现不同的基因型。两个位点均未发生突变，基因型为CYP2C19*1/*1；636位点未突变，681位点杂合突变和纯合突变，对应基因型分别为CYP2C19*1/*2和CYP2C19*2/*2；681位点未突变，636位点杂合和纯合突变，对应基因型分别是CYP2C19*1/*3和CYP2C19*3/*3；两个位点均发生突变对应基因型为CYP2C19*2/*3（见表2和图1）。

表2 CYP2C19和CYP2C9突变位点和基因型

CYP2C9*3是1075位点发生A→C突变。根据这个位点的突变情况分三种基因型：未发生突变的基因型为CYP2C9*1/*1，发生杂合突变的为CYP2C9*1/*3，发生纯合突变的为CYP2C9*3/*3（见表2和图1）。

2.2 CYP2C19和CYP2C9等位基因频率分布 在287例温州地区汉族人群中，CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因频率分别为65.16%、29.27%、5.57%；CYP2C9*1和CYP2C9*3等位基因频率分别为97.74%和2.26%（见表3）。经x2检验，P＞0.05，均符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究对象来自同一个群体，具有较好的代表性。

2.3 CYP2C19和CYP2C9基因型和表型频率分布 结果（见表4）表明，在287例标本中，CYP2C19基因型以CYP2C19*1/*1居多，CYP2C19*1/*2次之，未发现CYP2C19*3/*3型；CYP2C9各基因型中，以野生型CYP2C9*1/*1为主，共274例（占95.47%），CYP2C9*1/ *3有13例，未发现CYP2C9*3/*3型。基因表型中，CYP2C19弱代谢型有三种基因型（CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19*2/*3），本研究287例标本中CYP2C19弱代谢型的有42例，占14.63%；CYP2C9弱代谢型有两种基因型（CYP2C9*3/*3和CYP2C9*1/ *3），287例标本中CYP2C9弱代谢型有13例，占4.53%。

图1 CYP2C19和CYP2C9代表性测序峰图

表3 CYP2C19和CYP2C9等位基因频率分布

3 讨论

在中国人群中CYP2C19基因突变的主要类型是CYP2C19*2和CYP2C19*3[1]。CYP2C19*2是在第5外显子681碱基处发生单碱基突变（G→A），产生一个异常拼接位点，造成mRNA的阅读框架改变；CYP2C19*3发生在第4外显子的636碱基处（G→A），结果产生一个过早的终止子，导致编码蛋白合成缩短。这两个位点的突变都可引起代谢酶活性下降或缺失。野生纯合子为强代谢型（CYP2C19*1/*1），只有其中一个位点突变的为中间代谢型（CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3），其中一个位点纯合突变或两个点杂合突变为弱代谢型（CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、CYP2C19*2/*3）。CYP2C9在人类中存在多种突变体，其中在东亚人中最常见的突变是CYP2C9*3[2]。该位点突变会引起359位氨基酸变化（Ile359Leu，1075A＞C），破坏了蛋白底物识别位点区域内一个β折叠，从而影响蛋白功能。携带突变型基因的个体代谢相应药物能力较携带野生型基因个体为低，通常较易发生不良反应。比如CYP2C9参与代谢的抗凝血药华法林在临床中有广泛的应用，能较好地预防血液透析长期深静脉导管血栓形成，但出血风险相对较大[3]，所以国内外专家[4-5]建议该类药物根据基因型来确定药物的剂量。

表4 CYP2C19和CYP2C9基因型和表型频率分布

本研究发现，温州地区汉族人群CYP2C19具有遗传多态性，等位基因*1、*2、*3，分别为65.16%、29.27%和5.57%。其中CYP2C19*2远大于CYP2C19*3，未检测到CYP2C19*3/*3，说明CYP2C19*2是温州地区汉族人群弱代谢的主要原因。CYP2C19各基因表型中，弱代谢型占14.63%，跟已报道[5-6]的国内汉族人群基本相符，远高于白种人的3%～5%，跟日本人群的18.86%[7]相近。本研究中CYP2C9*3等位基因频率为2.26%，跟已报道的汉族人群（为2.94%）没有显著性差异，跟南方汉族人群基本一致（为2.44%）[8]，显著低于罗马尼亚人群的9.3%[9]和西班牙人群中的16.2%[10]，与日本的2.06%相近[11]。说明CYP2C19和CYP2C9具有种族差异。中国幅员辽阔，各地区既有相同的遗传背景又有各自的特点，了解本地区的药物代谢相关基因的多态性分布情况，对临床用药有重要的指导意义。本研究随机抽取温州地区287例汉族健康体检人员进行CYP2C19和CYP2C9常见多态位点进行检测，具有一定的代表性，希望能为本地区的遗传多态性分析和个体化用药提供参考。

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（本文编辑：吴健敏）

·论 著·

Objective:To investigate distribution status of CYP2C19 and CYP2C9 genotype in Wenzhou Han population.Methods:The CYP2C19 and CYP2C9 genotype of 287 Wenzhou Han Chinese were determined by sequencing.Results:In Wenzhou Han population, CYP2C19*1, CYP2C19*2 and CYP2C19*3 allele frequencies were 65.16%, 29.27% and 13.6%, respectively; CYP2C19*1/*1, CYP2C19*1/*2, CYP2C19*1/*3, CYP2C19*2/*3, CYP2C19*2/*2 and CYP2C19*3/*3 genotype frequencies were 44.95%, 33.45%, 6.97%, 4.18% and 0.00%, respectively. The frequency of CYP2C19 poor metabolisms was 14.63%; CYP2C9*1 and CYP2C9*3 allele frequencies were 97.74% and 2.26%, respectively; CYP2C9*1/*1 and CYP2C9*1/*3 genotype frequencies were 95.47% and 4.53%, respectively, CYP2C9*3/*3 homozygous genotype was not found in this study. Conclusion: The frequencie of CYP2C19 and CYP2C9 poor metabolisms are similar to those of Japanese population, whereas they are signifcantly different from America-European populations.

cytochrome P450; CPY2C19; CYP2C9; polymorphism; Wenzhou; Han population

Q39；R969.3

A

1000-2138（2014）12-0864-04

2014-05-05

国家青年科学基金资助项目（81200253）；浙江省重点科技创新团队资助项目（2012R10048）。

周怀彬（1981-），男，浙江永嘉人，助理实验师，遗传学硕士。

吕建新，教授，博士生导师，Email：jxlu313@163. com。

Analysis of genetic polymorphism of CYP2C19 and CYP2C9 in Wenzhou Han population

ZHOU Huaibin, WANG Jindan, HU Lihuai, WEN Chaowei, LV Jianxin. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035