白细胞介素17对大鼠肝星状细胞胶原代谢的影响

余盼攀，张启瑜，金慧成

（1.杭州市第一人民医院 普外科，浙江 杭州 310000；2.温州医科大学附属第一医院 普外科，浙江温州 325015）

白细胞介素17对大鼠肝星状细胞胶原代谢的影响

余盼攀1，张启瑜2，金慧成1

（1.杭州市第一人民医院 普外科，浙江 杭州 310000；2.温州医科大学附属第一医院 普外科，浙江温州 325015）

目的：探讨白细胞介素17（IL-17）对大鼠肝星状细胞（HSCs）增殖及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）表达的影响及其与肝纤维化的关系。方法：采用Optiprep密度梯度离心法分离HSCs并进行鉴定、传代。采用免疫细胞化学法检测IL-17作用HSCs 72 h后α肌动蛋白（α-SMA）表达的影响。采用MTT法检测IL-17作用HSCs 24、48和72 h后细胞的增殖情况。采用RT-PCR法和ELISA法分别检测IL-17作用HSCs后MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白表达的影响。结果：成功分离并培养HSCs，一定浓度的IL-17能促进HSCs α-SMA的表达并且促进HSCs增殖。IL-17能提高HSCs MMP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白的分泌，呈浓度依赖性，且TIMP-1/MMP-9比值随IL-17浓度增加而递增。结论：IL-17不仅促进HSCs增殖，还能促进α-SMA、MMP-9和TIMP-1的表达，同时提高TIMP-1与MMP-9的比值，可能在肝纤维化中扮演重要角色。

白细胞介素17；肝星状细胞；α肌白蛋白；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶组织抑制剂-1；大鼠

肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）主要位于肝窦周围间隙内，在生理情况下参与体内维生素A的代谢。HSCs的活化、增殖、凋亡及分泌细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）与肝纤维化的关系目前已经形成共识[1]。ECM的动态平衡主要由基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制因子（TIMPs）调节。而白细胞介素（IL-17）是由新型Th17细胞分泌的一种炎症因子，是介导炎症反应的主要细胞因子之一。研究显示，IL-17与多种肝脏疾病的发生发展存在密切关系[2-5]，但具体机制尚不清楚。本研究旨在观察IL-17对HSCs的增殖及胶原代谢的影响，进一步阐述IL-17与肝纤维化的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康成年雄性SD大鼠10只（温州医科大学动物实验中心提供），无特定病原菌级，体质量200～250 g，普通喂养，自由进食。

1.1.2 主要试剂：IV型胶原酶、DNA酶I均购自美国Sigma公司。Optiprep分离介质购自挪威Axisshield公司。大鼠α肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG二抗购自武汉博士德公司。鼠源重组IL-17购自英国PeproTech公司。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。四甲偶氮唑盐（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自Solarbio北京公司。大鼠MMP-9和TIMP-1 ELISA试剂盒购自美国R&D公司。反转录试剂盒和Trizol试剂盒均购自美国invitrogen公司。大鼠MMP-9和TIMP-1和内参GAPDH PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要仪器：超净工作台（苏州净化），PCR仪（德国Biometra公司），紫外分光光度计（美国Beckman公司），相差显微镜（日本Olympus公司），高速离心机（美国Beckman公司），CO2培养箱（SANYO公司），恒温水浴箱（丹麦Heto公司），荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离及分组：采用改良的Optiprep密度梯度法[6]分离大鼠HSCs。将细胞以5×105/mL接种于25 mL培养瓶中，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，24 h后首次换液去除未贴壁的细胞。以后每2～3 d换液1次，待细胞长满瓶底时0.25%胰酶消化传代。将细胞分为5个处理组：对照组、1 ng/mL IL-17组、10 ng/mL IL-17组、100 ng/mL IL-17组、500 ng/ mL IL-17组。

1.2.2 免疫细胞化学法检测HSCs、α-SMA表达：将对数生长期的HSCs以每孔3×104/mL接种入6孔板中进行细胞爬片，并加入IL-l7（100 ng/mL）进行处理，对照组加入等量0.9%氯化钠溶液，培养72 h后取出进行染色，PBS冲洗3次后4%多聚甲醛固定15 min，3% Triton X-100透膜30 min，封闭，滴加一抗（4 ℃过夜），PBS冲洗，滴加二抗孵育30 min，DAB试剂盒进行显色，苏木素染色2 min，依次在75%、85%、95%、100%乙醇中脱水，封片观察。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖情况：将对数生长期的HSCs以每孔3×103/mL细胞接种入96孔板中，培养24 h，换无血清的DMEN饥饿过夜使细胞同步化。按照上述分组进行处理，每组设6个复孔。于37 ℃、5% CO2条件下继续培养24、48和72 h后弃上清，每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT 20μL，37 ℃作用4 h后弃作用液，各孔加入DMSO 150μL，震荡10 min，使结晶充分溶解，全自动酶标仪于490 nm波长检测各孔吸光度（OD）。

1.2.4 RT-PCR法检测细胞MMP-9和TIMP-1mRNA表达水平：取对数生长期HSCs，按1×105/mL细胞接种于六孔板内培养，按照上述分组处理，培养24 h后收集细胞用于总RNA提取，RNA提取采用Trizol法。取等量的RNA按照反转录试剂盒说明书进行反转录。对反转录的cDNA进行PCR扩增：引物序列GAPDH引物上游5’-GTGCGATGGCGTGCTATG-3’，下游5’-GGGTGG TCCAGGGTTTCTTA-3’，片段长度280 bp；TIMP-1引物上游5’-TCCTCTTGTTGCTATCATTGATAGCTT-3’，下游5’-CGCTGGTATAAGGTGGTCTCGAT-3’，片段长度148 bp；MMP-9引物上游5’-CAGTGTAGGCGTGGGTCCAGTA-3’，下游5’-CCAAGAACTTCCGACTATCCAATGA-3’，片段长度110 bp。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30～35次。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，利用Gel-Pro分析软件分析条带。

1.2.5 ELISA法检测细胞培养上清MMP-9和TIMP-1蛋白量：HSCs以3×105/mL接种于24孔板中，待细胞贴壁并同步化后按上述分组处理细胞24 h终止培养，取细胞培养液离心去除沉淀，取上清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。每组设3个复孔，操作结束后将ELISA板置于酶标仪上450 nm波长下读取各孔吸光度值，根据标准曲线计算出MMP-9和TIMP-1的含量。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS17.0统计学软件。数据用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSCs的分离、培养及鉴定 采用Optiprep密度梯度离心法分离HSCs，平均细胞得率2×107个/肝。经0.4%锥虫蓝染色，细胞存活率在90%以上。荧光显微镜下新分离的细胞自发淡蓝色荧光，见图1。相差显微镜下，新分离的HSCs呈圆形，具有很强的折光性，体积明显小于肝细胞，培养至5 d左右细胞外观呈现出明显的梭形，胞浆内颗粒减少，细胞逐渐融合成片状生长，见图2。

图1 新分离HSCs自发荧光（×400）图2 相差显微镜下培养5 d的HSCs（×200）

2.2 IL-17促进HSCs α-SMA的表达 IL-17作用体外培养5 d的HSCs 72 h，免疫细胞化学染色法测定α-SMA在HSCs中表达情况，可见阳性染色的α-SMA位于胞质内，呈高张力纤维状分布，IL-17（100 ng/ mL）处理组比空白对照组HSCs α-SMA的表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），结果见图3。

2.3 IL-17促进HSCs增殖 MTT结果显示，在一定时间和浓度下，IL-17具有促进HSCs增殖的作用。IL-17作用HSCs 24 h后，随药物浓度的增高，细胞的增殖有增高的趋势，但各浓度组与对照组比差异均无统计学意义（P＞0.05）。当作用48、72 h，药物浓度在10、100和500 ng/mL时，随着作用时间的延长和药物浓度的增加，增殖作用越显著，各组与对照组比差异有统计学意义（P＜0.01）。IL-17作用HSCs 72 h，100 ng/mL与500 ng/mL组比差异无统计学意义（P＞0.05），说明在作用72 h后IL-17促HSCs增殖作用可能在100 ng/mL时基本达到饱和，见表1。

图3 培养5 d HSCs α-SMA免疫染色（×400）

表1 不同浓度IL-17作用HSCs不同时间细胞增殖OD值（n=6，±s）

表1 不同浓度IL-17作用HSCs不同时间细胞增殖OD值（n=6，±s）

组别24 h48 h72 h 10.304±0.0280.367±0.0300.671±0.027 20.307±0.0270.372±0.0320.717±0.048 30.321±0.0130.411±0.024a0.765±0.037a40.324±0.0120.500±0.018a0.853±0.038a50.326±0.0290.524±0.017a0.871±0.046a注：1：对照组；2：1 ng/mL IL-17组；3：10 ng/mL IL-17组；4：100 ng/ mL IL-17组；5：500 ng/mL IL-17组。与对照组比：aP＜0.01

2.4 IL-17促进HSCs MMP-9和TIMP-1 mRNA表达RT-PCR结果显示，IL-17作用于HSCs 24 h能明显促进MMP-9和TIMP-1 mRNA表达，除1 ng/mL组外，其余各浓度组与对照组比差异均有统计学意义（P＜0.01），并且呈浓度依赖性。如图4-5可知，TIMP-1 mRNA表达量明显强于MMP-9 mRNA表达量，且TIMP-1/ MMP-9 mRNA比值随浓度增加而递增，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 不同浓度IL-17对HSCs MMP-9 mRNA表达的影响

图5 不同浓度IL-17对HSCs TIMP-1 mRNA表达的影响

2.5 IL-17对HSCs分泌MMP-9和TIMP-1蛋白的影响如表2所示，IL-17能明显促进HSCs MMP-9、TIMP-1蛋白的分泌，除1 ng/mL组外，其余各浓度组与对照组比均明显增强，差异有统计学意义（P＜0.01），并且随着作用浓度的提高，MMP-9和TIMP-1蛋白量也逐渐提高，呈浓度依赖性。下表可知TIMP-1蛋白含量明显高于MMP-9，TIMP-1/MMP-9比值随浓度增加而递增，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 不同浓度IL-17作用大鼠HSCs后MMP-9和TIMP-1蛋白水平（n=6，±s）

3 讨论

肝纤维化是一个慢性的病理过程，是肝硬化的中间环节，是一种可逆的损伤-修复反应[7]。虽然多种因素能够引起肝纤维化，但HSCs的激活、增殖及分泌ECM仍然是肝纤维化形成的重要过程[8]。HSCs被激活后，转变为肌成纤维细胞并特异性表达α-SMA，说明α-SMA是HSCs活化的标志，也是提示肝纤维化严重程度的指标之一[9]。目前研究证实，多种细胞因子如转化生长因子β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-1、IL-6等都能经过多种途径促进HSCs的活化、增殖及胶原合成，从而引起肝纤维化[10]。MMPs是调节ECM动态平衡的重要酶系，TIMPs是一种能抑制MMPs功能的活性多肽[11]。在肝组织中MMPs和TIMPs主要由活化的HSCs产生。由于肝脏ECM代谢主要由MMPs和TIMPs共同调节，目前观点认为MMPs和TIMPs的失衡也是肝纤维化形成的重要因素[12]。MMP-9是一种明胶酶B。有研究表明，在肝纤维化早期MMP-9的基因表达显著增强，但在肝硬化期表达量则呈下降趋势，说明MMP-9对肝硬化的发生发展具有双重的调节作用。MMP-9不仅能降解异常沉积的ECM，还可降解由IV型胶原构成的肝脏正常的基底膜及正常的肝组织，从而破坏HSCs与ECM间的动态平衡，激活并促进HSCs增殖。TIMP-1则不仅能抑制降解异常ECM的MMPs的活性，而且还可以抑制酶原的激活使ECM降解减少，两者共同促进肝纤维化的发生、发展。

IL-17细胞因子家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（IL-25）和IL-17F。通常我们研究的IL-17为IL-17A。IL-17是一类由CD4+ T细胞亚型—Th17细胞分泌的前炎症因子，其对中性粒细胞有强大的趋化作用，促进多种前炎症因子（IL-6、IL-8、MCP-1等）释放，在介导炎症反应过程中发挥重要的作用[13]。研究表明，各种肝脏疾病患者血清IL-17水平较正常组显著升高，说明IL-17在多种肝病的发生发展中起重要作用。但IL-17是否能通过促进HSCs活化、增殖及MMP-9和TIMP-1的表达从而促进肝纤维化的发生发展目前鲜有报道。

本实验观察到，IL-17在一定浓度能促进HSCs α-SMA的表达，说明IL-17能促进HSCs活化。10、100、500 ng/mL的IL-17作用HSCs 48、72 h具有明显促进其增殖的作用，并且呈浓度-时间依赖性。同时，IL-17作用HSCs 24 h能显著提高MMP-9和TIMP-1 mRNA表达和蛋白的分泌，IL-17浓度在10、100、500 ng/mL范围时，随着浓度的增高MMP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白表达逐渐增高，各浓度组与对照组比差异均有统计学意义（P＜0.01）。另外我们观察到，在一定浓度范围内，TIMP-1/MMP-9的比值也随药物浓度的增加而增加。

综上所述，IL-17在肝纤维化发生发展中的作用可能是：①激活HSCs，使之具有成纤维细胞活性；②促进HSCs的增殖，分泌更多的ECM；③提高HSCs MMP-9的表达，促进正常的基底膜的降解，破坏HSCs的微环境，从而促进HSCs的激活和迁移；④促进HSCs TIMP-1的表达，抑制MMPs（主要为MMP-1/MMP-13）的活性，抑制ECM的降解；⑤提高HSCs TIMP-1/ MMP-9的比值，破坏TIMPs/MMPs的平衡，使ECM代谢紊乱。

因此，通过抑制IL-17及其受体的表达、阻断其信号转导通路或许能够为肝纤维的预防和治疗提供新的思路。

[1] Friendman SL. Hepatic fbrosis—overview[J]. Toxicology, 2008, 254(3): 120-129.

[2] Zhang JY, Zhang Z, Lin F, et al. Interleukin-17-producing CD4(+) T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B[J]. Hepatology, 2010, 51(1): 81-91.

[3] Lemmers A, Moreno C, Gustot T, et al. The interleukin-17 pathway is involved in human alcoholic liver disease[J]. Hepatology, 2009, 49(2): 646-657.

[4] Lan RY, Salunga TL, Tsuneyama K, et al. Hepatic IL-17 responses in human and murine primary biliary cirrhosis[J]. J Autoimmun, 2009, 32(1): 43-51.

[5] Yasumi Y, Takikawa Y, Endo R, et al. Interleukin-17 as a new marker of severity of acute hepatic injury[J]. Hepatol Res, 2007, 37(4): 248-254.

[6] 余盼攀, 张胜初, 季世强, 等. Optiprep法分离SD大鼠肝星状细胞的实验研究[J]. 温州医学院学报, 2011, 41(6): 511-514.

[7] Hernandez GV, Friendman SL. Pathogenesis of live fbrosis [J]. Annu Rev Pathol, 2011, 6(2): 425-456.

[8] Zhong MT, Xiao FQ, Run QJ, et al. IL-17A plays a critical role in the pathogenesis of liver fbrosis through hepatic stellate cell activation[J]. J Immunol, 2013, 191(7): 1835-1844.

[9] Chen YW, Lid G, Wu JX, et al. Tetrandrine inhibits the ac-tivation of rat hepatic stellate cells via upregulation of smad7[J]. Chem Pharmacol Bull, 2005, 21(5): 563-567.

[10] Han YP, Zhou L, Wang JH, et al. Essential role of matrixmetallop roteinases in interleukine-1-induced myofbroblastic activation of hepaticstellate cell in collagen[J]. J Biol Chem, 2004, 279(2): 4820-4828.

[11] Stefanie H, Jürgen G, Martin R, et al. Expression of MMPs and TIMPs in liver fbrosis-a systematic review with special emphasis on anti-fibrotic strategies[J]. J Hepatol, 2007, 46(5): 955-975.

[12] Roderfeld M, Hemmann S, Roeb E. Mechanisms of fbrinolysis in chronic live injury (with special emphasis on MMPs and TIMPs)[J]. Z Gastroenterol, 2007, 45(3): 25-33.

[13] Moseley T. Interleukin-17 family and IL-17 receptors[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2003, 14(2): 155-174.

（本文编辑：吴健敏）

Objective:To investigate the effect of Interleukin17 (IL-17) on proliferation and expression of MMP-9, TIMP-1 in rat hepatic stellate cells in vitro.Methods:The HSCs were isolated by method of Optiprep. Immunocytochemical method was used to detect the α-SMA expression of HSCs. The HSCs was treated with different concentrations of IL-17 and the proliferation of HSCs was measured by MTT. The MMP-9 and TIMP-1 mRNA levels were detected by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). While the MMP-9 and TIMP-1 protein were measured by ELISA.Results:HSCs were isolated and cultured successfully. Stimulated with IL-17 could signifcantly increase proliferation and α-SMA expression in HSCs. IL-17 could promote the MMP-9 and TIMP-1 mRNA expression and increased protein secresion in HSCs by dose depedent manner. With increased of IL-17 concentration, the value of TIMP-1/MMP-9 was markedly upregulated. Conclusion: IL-17 can promote the proliferation of HSCs and also increases α-SMA, MMP-9 and TIMP-1 expression, then upregulate the value of TIMP-1/MMP-9 in HSCs, which may play an important role in live fbrosis.

interleukin17; hepatic stellate cells; α-SMA; MMP-9; TIMP-1; rats

R657.3

A

1000-2138（2014）12-0868-05

2014-05-15

浙江省外科学重中之重学科基金资助项目（2008-255）。

余盼攀（1986-），男，浙江衢州人，住院医师，医学硕士。

Effect of interleukin17 on collagen metabolism in hepatic stellate cells

YU Panpan1, ZHANG Qiyu2, JIN Huicheng1. 1.Department of General Surgery, the First People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou, 310000; 2.Department of General Surgery, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015