UPLC-Q-TOF快速测定常见氨基酸含量

王 洋， 武利庆， 杨 屹

（1.北京化工大学，北京 100029；2.中国计量科学研究院，北京 100013）

UPLC-Q-TOF快速测定常见氨基酸含量

王 洋1， 武利庆2， 杨 屹1

（1.北京化工大学，北京 100029；2.中国计量科学研究院，北京 100013）

结合外标法或同位素稀释质谱法，建立UPLC-Q-TOF快速定量氨基酸分析方法。在无离子对试剂及衍生化情况下，实现对样品中氨基酸的快速测定。采用外标法测定时，14种常见氨基酸在其相应线性范围内，r2为0.953～0.999，LOD为0.001～0.080mg/g，CV为1.4%～9.8%；采用Q-TOF外标法定量时，CV为1.5%～8.0%，误差为-9.1%～40%；采用同位素稀释质谱法测定各氨基酸浓度时，CV为1.4%～3.8%，误差为-3.4%～3.7%。本方法可在2min之内完成14种氨基酸的分离和定量，大大缩短分析时间。同时由于采用高分辨的飞行时间质谱，避免检测时离子间的相互干扰，提高测定结果的准确性，可用于蛋白质标准物质均匀性、稳定性检验及定量。

氨基酸；UPLC-Q-TOF；定量；外标法；同位素稀释；质谱

0 引 言

氨基酸是蛋白质的基本组成单元，氨基酸分析是经典的蛋白质定量方法，准确测定样品中氨基酸含量是蛋白质准确定量的前提。

目前，氨基酸的分析检测方法主要有反相高效液相色谱法（RP-HPLC）[1]、毛细管电泳-质谱法（CE-MS）[2]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[3]以及液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[4]。在采用RP-HPLC和CE作为分离手段时，往往需要将待测样品衍生、转化为具有紫外可见吸收或能产生荧光的物质，以便于检测。在采用GC时，也要在柱前将待测样品衍生为易挥发性物质才可以[5]。而衍生试剂不稳定、衍生化操作繁琐，衍生出的副产物会干扰分析，具有重现性差、准确度低等缺陷[6]。LC-MS分析时，在流动相中加入离子对试剂可以提高氨基酸在反相色谱柱中的保留，省去衍生化的繁琐过程；但是，离子对试剂会抑制信号强度，通常LC-MS分析时间为十几到几十分钟[7-10]。

为了克服上述方法的缺点，Qu等[11]首先尝试在不使用离子对试剂的情况下采用三重四级杆（QQQ）质谱进行氨基酸定量，此时各种氨基酸得不到充分的分离，谱峰重叠严重，由于质谱分辨率较低，对定性和定量分析造成了干扰。本文借助飞行时间质谱（time of flight，TOF）的高分辨能力，在不使用离子对试剂的情况下对14种常见氨基酸进行分离，克服了谱峰重叠干扰和离子歧视效应，取得了较为满意的效果。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

nanoUPLC-Synapt G2（Waters公司）；TSQ Vantage（Thermo Fisher公司）。超纯水（取自Milli-Q，MILLIPORE），乙腈（色谱纯），甲酸（分析纯），全氟庚酸（纯度98%），三氟乙酸（色谱纯），非标记氨基酸（美国Sigma Aldrich公司），标记氨基酸（美国剑桥同位素公司）。

1.2 标准溶液的配制

外标法：准确配制质量浓度为10mg/g的氨基酸标准溶液，逐级稀释至从0.01，0.1，1，3，5mg/g小到大。另配氨基酸质量浓度约为0.1mg/g的溶液作为待测样品。

同位素稀释质谱法（ID-MS）：分别取1 mg/g脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和精氨酸配制成非标记混标及与其对应的标记氨基酸混标。配制成高标、低标和待定值样品。

1.3 四级杆-飞行时间（Q-TOF）质谱实验参数

1.4 三重四级杆（QQQ）质谱实验参数

色谱条件：色谱柱为Agilent SB-Aq，2.1 mm×100mm；流速0.2mL/min，梯度条件见表1，A相是含0.8mmol PFHA和0.05%TFA的水溶液，B相是乙腈（表1）。采用Thermo Fisher公司的TSQ Vantage质谱多反应监测模式捕获：苯丙氨酸（166→120），苯丙氨酸-13C9（175→128），脯氨酸（116→70），脯氨酸-13C5（121→74），缬氨酸（118→72），缬氨酸-13C5（123→76），亮氨酸（132→86），亮氨酸-D10（142→96）。

1.5 溶菌酶水解

1）准确配制质量浓度为1mg/mL蛋白溶液。

2）根据蛋白的氨基酸中缬氨酸含量，配制非标记混标、标记混标溶液。

3）取等量蛋白溶液和标记混标溶液，置于2 mL安瓿瓶中，40℃离心干燥。

4）加500 μL 6 mol/L盐酸，氮吹2 min，封口。110℃，烘24h。

5）取出后，氮气吹干，加500μL 0.1 mol/L盐酸，过滤，同时配制相应的低标和高标溶液进行质谱分析。

变异系数：

式中：xi——测定结果；

n——总共实验次数；

i——实验编号。

误差：

式中：c测——测出的氨基酸质量浓度；

c标准值——用氨基酸标准物质配制的氨基酸

质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 nano-UPLC-Q-TOF质谱法评价

当采用外标法进行定量时（见表2），14种氨基酸在0.01～10mg/g范围内呈较好的线性关系，r2的范围为 0.953～0.999，LOD 0.001～0.080 mg/g，CV 1.4%～9.8%。Q-TOF外标法定量的结果与传统的QQQ外标法定量结果相比（见表3），Q-TOF外标法测定结果与标准值之间的的误差范围为-9.1%～40%，CV为1.5%～8.0%；传统的QQQ分析方法对同种样品分析结果的的误差为-9.1%～20%，CV为0.13%～7.8%。可见，由于Q-TOF质谱检测原理的限制，基于Q-TOF的氨基酸定量结果的准确度及重复性不如传统的三重串联四级杆质谱；但是，其准确度和重复性也能满足一般的应用需求，尤其是基于Q-TOF的氨基酸定量可以在不使用离子对的情况下将14种氨基酸在2 min内出峰完毕进行定量，与文献[7-10]相比，大大地缩短了分析时间。采用Q-TOF质谱，与文献[11]中不添加离子对试剂的QQQ质谱法相比，Q-TOF高分辨、无离子歧视效应的优点，使得氨基酸检测与定量更加准确。

表1 QQQ-ID-MS定量氨基酸的液相梯度条件

表2 外标法测定氨基酸得到的方法学参数

表3 两种不同分析方法的外标法定值结果比较（n=5）

同位素稀释质谱法（ID-MS）是一种高准确度的蛋白绝对定量方法，所以本文还对基于Q-TOF的ID-MS方法进行了研究。将蛋白质定量中常用的4种稳定氨基酸（脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸）配制成混标溶液，采用括弧法对样品溶液中目标氨基酸的浓度进行ID-MS分析。基于Q-TOF的氨基酸IDMS定量结果与传统的QQQ质谱定量结果相比（见表4），前者与标准值之间的的误差范围为-3.4%～3.7%，CV为1.4%～3.8%；而后者对同种样品IDMS定量结果的误差为-1.4%～1.2%，CV为0.7%～2.5%。可见，当使用同位素标记物作为内标时，显著提升了Q-TOF在定量方面的方法学性能，同时具备不使用离子对试剂、分析速度快的优点，可用于蛋白质标准物质的均匀性、稳定性检验及定值中。

表4 两种不同分析方法的ID-MS定值结果比较（n=6）

2.2 nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法的应用

为了检验nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法在蛋白质标准物质研制中的应用，将其应用于溶菌酶标准物质的均匀性检验中。随机选取7瓶标准物质，水解后通过测定水解液中缬氨酸的含量评价标准物质的瓶间均匀性，同时与QQQ质谱的的评价结果相比较，见表5和表6。两种方法得到的溶菌酶质量浓度分别为0.891g/g和0.887g/g，经t检验，p=0.73457，可见两种方法的测定结果差异不显著；采用两种方法均匀性检验统计量F值均小于查表值，说明溶菌酶样品是均匀的，两种方法得到的结论一致。由于QTOF质谱法的分析时间远小于传统的QQQ质谱方法，因此，在标准物质均匀性检验、稳定性检验等需要大量重复性实验时，使用Q-TOF质谱法可以显著缩短分析时间。

表5 Q-TOF质谱应用于ID-MS测定溶菌酶均匀性检验结果

表6 QQQ质谱应用于ID-MS测定溶菌酶均匀性检验结果

3 结束语

本文建立了nano-UPLC-Q-TOF质谱法快速检测、定量样品中氨基酸含量的方法，不需添加离子对试剂和氨基酸衍生化，操作更简便。采用外标法测定时，14种常见氨基酸在0.01～10 mg/g范围内r2为0.953～0.999，LOD为0.001～0.080 mg/g，CV为1.4%～9.8%。采用Q-TOF外标法定量氨基酸浓度时，CV为1.5%～8.0%，与标准值相比误差为-9.1%～40%；采用ID-MS测定各氨基酸浓度时，CV为1.4%～3.8%，与标准值相比的误差为-3.4%～3.7%。本方法可在2min之内完成14种氨基酸的分离和定量，大大缩短了分析时间。同时由于采用了高分辨的飞行时间质谱，避免了检测时离子间的相互干扰，提高了测定结果的准确性。本方法与传统QQQ质谱分析方法相比，在外标法测定氨基酸含量时虽然不如QQQ方法的准确度与重复性好，但是也能满足一般要求；在IDMS测定氨基酸含量时，由于采用同位素内标消除了样品前处理、离子化效率、分离过程中的系统误差，显著提升了基于Q-TOF定量的准确度，准确度与重复性都能控制在4%以内；在提升准确度和重复性的同时，能够简化流动相配制、缩短分析时间，可用于需要大量重复测定蛋白质浓度的场合，在基本不损失准确度的情况下显著节约分析时间和分析成本，可用于蛋白质标准物质均匀性、稳定性检验及定值实验等。

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Rapid method of quantitative detection of common amino acids with UPLC-Q-TOF

WANG Yang1，WU Li-qing2，YANG Yi1
（1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China）

In this work，a new method of UPLC-Q-TOF had been proposed for the rapid and accurate detection of common amino acids.Without derivatization and using ion-pair regent，amino acids were analyzed fast and accurately.This study could be applied with both external standard method and ID-MS.For external standard method，ther2of each amino acid was from 0.953 to 0.999，the LOD was from 0.001 mg/g to 0.080 mg/g and the CV was from 1.4%to 9.8%.For the quantitation of 14 amino acids with the external standard method，the CV was from 1.5%to 8.0% and the bias was from-9.1%to 40%compared with standard values.For ID-MS，the CV was from 1.4%to 3.8%and the bias was from-3.4%to 3.7%compared with standard values.14 common amino acids could be analyzed in 2 minutes，which reduced the analysis time greatly.With highresolution TOF mass spectrometry，this method avoids the interference of ion overlapping，which can improve the accuracy of measurement results，and will be well applied in homogeneity and stability testing of protein certified reference materials.

amino acids；UPLC-Q-TOF；quantitation；external standard；isotope dilution；mass spectrometry

O517；O629.73；O657.63；TM930.114

：A

：1674-5124（2014）05-0070-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.018

2013-12-25；

：2014-02-02

国家科技支撑计划项目（2012BAK26B04）国家质检总局科技项目（2013QK048，201310008）

王 洋（1988-），女，天津市人，硕士研究生，专业方向为分析化学。