模拟失重大鼠胃窦肌层Cox-2表达和血清SS及VIP水平的变化

李正鹏，郭彪，李晓鸥，段育忠，王平，张宏文，周金莲，崔彦，杨鹤鸣

随着我国载人航天活动的日益频繁和空间技术的迅速发展，对于失重状态下航天员身体各系统器官病理生理变化的研究显得愈加重要。失重状态下，胃的节律运动功能及其消化液的极性运动必然受到影响，国内外在这方面的研究报道相对较少[1-4]。本研究采用尾悬吊方法模拟失重环境，检测微重力环境下大鼠胃窦肌层组织中诱生型环氧化酶2(cyclooxygenase-2，Cox-2)、血清生长抑素(somatostatin，SS)及血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)水平的变化，探讨失重状态对大鼠胃窦动力学的影响，为航天员训练和飞行的医疗保障提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 经医院伦理委员会批准后进行动物实验。采用清洁级健康成年雄性Wistar大鼠64只，体重200±20g，购自中国农业大学实验动物研究所。采用尾悬吊法建立模拟失重动物模型[5]。实验步骤和组织采集过程参照前期文献报道[6]。动物经适应性饲养7d后进行实验，采用随机数表法将实验动物随机分为8组，分别为悬尾6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d和0h(对照)组(n=8)。各组悬吊结束前6h禁食水，称量体重后腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)麻醉，无菌操作，经腹正中线剖腹，显露下腔静脉并抽取血样本，然后沿胃大弯剪开，纵行取腺胃胃窦区(包含幽门括约肌)组织，将黏膜层和肌层分离，分别保存于液氮中。另取纵行胃窦组织浸于4%多聚甲醛(pH 7.4)中固定，常规石蜡包埋。

1.2 RT-PCR检测大鼠胃窦肌层组织中Cox-2mRNA表达 根据GenBank设计引物序列。Cox-2：上游5'-AGACAGATTGCTGGCCGGGTTG-3'，下游5'-TTCAGGGAGAAGCGTTTGCGGT-3'，扩增片段长度137bp；GAPDH：上游5'-GGTTGTCTCCTGCG ACTTCA-3'，下游5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCT TA-3'，扩增片段长度186bp。提取总RNA，测RNA浓度，采用Oligo(dT)合成cDNA第一条链行反转录，取2μl反转录产物cDNA加至PCR反应体系中，上下游引物各0.4μl，反应总体积20μl。PCR反应条件为：94℃ 5min；95℃ 10s，57℃ 30s，72℃ 30s，37个循环；72℃延伸10min。采用AlphaImger 2200Soft ware电泳凝胶图像分析系统进行灰度扫描，分析各实验组及对照组条带的光密度(A)值及相应比值，计算各组Cox-2mRNA表达水平。

1.3 Western blotting检测大鼠胃窦肌层组织Cox-2蛋白表达 取冻存胃窦肌层组织，在液氮预冷的研钵中研碎，加入组织裂解液(含蛋白酶抑制剂)，冰上放置20min，低温下12000r/min离心15min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。80V电泳1h后按电转印标准方法转移至PVDF膜上，丽春红染液染色，洗脱；采用TBST+5%脱脂奶粉溶液1:500稀释一抗(美国Abcam)，4℃水平摇床过夜；采用TBST溶液洗膜10min×3次，加入用TBS溶液稀释的生物素标记的羊抗兔二抗(1:5000，美国Zymed)，室温摇床孵育2h，TBST洗膜10min×3次。分析免疫标记条带的A值(AlphaImager 2200software)。

1.4 免疫组化检测大鼠胃窦肌层组织中Cox-2蛋白表达 石蜡包埋胃窦组织后切片(厚5μm)，常规脱蜡水化；3%过氧化氢灭活内源性过氧化物，室温下封闭内源性过氧化物酶20min；将切片放入0.01mol/L pH 6.0枸橼酸钠缓冲液中，用微波加热修复，继用高火煮沸溶液，中火维持5min×4次，静置至室温，PBS溶液洗5min×3次；采用10%正常羊血清在室温下孵育1h，加入1:200兔抗鼠Cox-2多克隆抗体(美国Abcam)，4℃孵育过夜；加入生物素标记的羊抗兔IgG(美国Zymed)，常温下孵育2h，PBS洗涤5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(美国Zymed)，常温下孵育2h，PBST洗涤5min×3次，PBS洗5min×3次；DAB显色，复染，脱水，透明，封片，显微镜下照相。Cox-2结果判定：以细胞核和(或)胞质中有明显的棕黄色颗粒为阳性。使用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.5 血清SS和VIP水平测定 取血液标本，装于灭菌离心管中，4℃过夜；3000r/min离心10min分离血清，所有操作均在冰上进行，–80℃保存。按SS和VIP放免试剂盒(北京华英生物技术研究所)说明书操作，测定各组血清标本的放射性计数。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有数据采用x±s表示，正态分布及方差齐性检验后，多个样本间的比较采用单因素方差分析，各模拟失重时相与正常对照(0h)之间均数的两两比较采用LSD-t检验，多个均数之间的两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组Cox-2mRNA的表达 模拟失重各组及对照组大鼠胃窦肌层组织中均有Cox-2mRNA表达。失重6h大鼠胃窦肌层组织中Cox-2mRNA的表达水平即出现显著增高，12h、1d组仍呈高水平表达，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。大鼠胃窦肌层组织中Cox-2mRNA的表达从失重2d开始表达逐渐回落，3d、5d、7d组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05，图1A)。

2.2 各组Cox-2蛋白的表达 Cox-2蛋白在各组大鼠胃窦肌层组织中均有不同程度表达，悬吊6h后Cox-2蛋白表达水平显著升高，12h、1d组持续高表达，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，2、3、5、7d时Cox-2蛋白表达水平明显下降，与对照组相比差异无统计学意义(图1B)。

2.3 免疫组化染色观察Cox-2蛋白表达 Cox-2蛋白阳性表达为棕褐色。对照组大鼠胃窦平滑肌部分胞质染色呈弱阳性(图2A、B)。悬吊6h、12h、1d大鼠胃窦平滑肌细胞胞质染色加深，部分胞核染色亦呈阳性(图2C、D)。悬吊2d后大鼠胃窦平滑肌胞核染色逐渐恢复，与对照组相似但染色略深(图2E、F)。阴性对照平滑肌胞核及胞质均未见着色(图2G、H)。

图1 模拟失重大鼠胃窦平滑肌Cox-2mRNA (A)和蛋白(B)的表达变化Fig.1Expression of Cox-2mRNA and protein in gastric antrum muscular layer of simulated weightlessness rats

2.4 血清SS、VIP水平测定结果 模拟失重大鼠血清SS水平在尾悬吊2～3d达峰值，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。在尾悬吊6、12h阶段，血清VIP水平明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。随着尾悬吊时间的延长，血清VIP水平呈逐渐下降趋势，5d时又有一定程度上升，7d时VIP水平明显高于对照组(P＜0.05，图3)。

图2 免疫组化染色观察模拟失重大鼠胃窦平滑肌Cox-2的表达(DAB)Fig.2Expression of Cox-2protein in gastric antrum muscular layer of simulated weightlessness rats by immunohistochemistry (DAB)

3 讨 论

胃维持正常生理功能主要依赖于自身3种不同类型的节律运动，并受胃肠肌电及多种神经体液因素的影响。胃平滑肌细胞作为“壁内神经-ICC-平滑肌”这一基本运动模式的直接承受者，其特异性受体与胃肠激素及多种体液因子相结合进而调控胃平滑肌细胞的信号转导，是影响胃动力的主要内在因素[7-8]。

图3 模拟失重大鼠血清SS、VIP水平变化Fig.3Changes of serum concentration of SS and VIP in simulated weightlessness rats

Cox是前列腺素(PGs)合成所必需的酶，也是PGs合成初始步骤中的关键限速酶。Cox有两种同工酶，其中Cox-1为结构型，被称为要素酶、管家酶或生理性酶，Cox-2为诱导型，被称为病理性酶[9]。Cox-2在胃黏膜层表达已有较多研究，结果显示各种化学、物理和生物性损伤因素均能诱导其生成，进而催化PGs的合成，参与炎症反应并促发胃黏膜癌变[10-12]。但关于Cox-2在胃平滑肌层的作用、机制及影响因素方面的研究目前仍比较局限[13]。

本实验结果显示，在尾悬吊模拟失重应激状态下，大鼠胃窦平滑肌细胞的Cox-2表达发生了明显变化，Cox-2mRNA及蛋白在早期即出现同步高表达，胃窦平滑肌细胞胞质染色加深且出现部分核染色阳性。结合文献分析认为，失重状态本身作为一种不良刺激可诱导胃窦平滑肌细胞表达Cox-2，进而通过影响PGs合成等途径上调细胞内Ca2+浓度，使肌球蛋白轻链磷酸化水平升高，导致平滑肌收缩增强[8]。然而，失重状态引发的是系列连锁反应，而不仅仅是胃窦平滑肌细胞内Cox-2的表达变化。笔者在前期研究中发现，尾悬吊模拟失重导致大鼠胃窦组织中c-kit mRNA及蛋白表达明显下调，肌层Cajal间质细胞(ICC-MY)染色减弱、连续性中断，肌内ICC-IM染色减弱的同时c-kit阳性ICC也明显减少[6]。显然，微重力因素的综合效应可能使胃起搏电流和慢波产生紊乱，胃平滑肌节律运动失调，从而引发胃动力障碍。另外，鉴于Cox-2是一种炎性因子，亦不能排除其具有通过反馈性调节相关基因的表达从而完成损伤修复的功能。结合笔者前期研究发现随着模拟失重时间的延长，Cox-2表达异常可较快恢复而Cajal间质细胞的功能恢复较慢[6]，推测它们可能通过不同的通路进行自我调节并影响胃窦动力。

本实验结果还显示，随着尾悬吊时间延长，胃窦Cox-2蛋白及mRNA表达虽有波动，但总体趋势为向正常水平恢复，提示机体可能通过应激代偿机制对模拟失重环境造成的反应和损伤进行修复并得以适应。同时我们也注意到，Cox-2表达经过一定程度的恢复后，仍高于正常水平，表明尾悬吊模拟失重刺激的持续存在仍对胃窦动力有一定影响，这与本研究中血清SS、VIP的持续波动及笔者前期有关模拟失重条件下血浆胃动素持续明显升高和Cajal间质细胞状态相吻合[5]。我们前期的研究结果还显示，尾悬吊模拟失重可导致胃黏膜组织超微结构改变，并伴随胃黏膜组织中Cox-2表达明显升高，Cox-2在胃黏膜失重应激反应过程中发挥重要作用[14]。阻断对Cox-2的诱导或选择性应用Cox-2抑制剂，可避免或减轻胃黏膜应激反应，并能维护胃平滑肌的节律运动，对其具体作用及机制有必要进一步深入探讨。

脑肠肽是在中枢神经系统和胃肠道双重分布的调节肽，也是影响胃动力的重要因素。SS作为一种重要的抑制性脑肠肽，可抑制胃肠腺体分泌和其他胃肠肽的释放，同时可通过神经内分泌和旁分泌及抑制乙酰胆碱和其他胃肠激素的方式抑制胃肠运动[15-16]。VIP主要由胃肠道黏膜及肌层释放，对胃肠平滑肌起直接抑制作用，可延缓胃排空，并能抑制胃酸和胃泌素的分泌[16-17]。本实验结果显示，大鼠血清SS浓度在尾悬吊模拟失重2～3d达峰值，其他各时间点浓度值波动明显，未能明确其变化规律，可能与实验时间短以及SS半衰期极短等因素有关。SS的这种变化可能源于机体对持续模拟失重条件下的应激性反应及适应性变化，同时也反映出胃肠运动调控的复杂性。本实验结果还显示，大鼠血清VIP浓度在尾悬吊模拟失重早期即显著升高，其后经过2～3d的回落后复又升高。这种变化的直接后果是抑制胃酸分泌和延缓胃排空。

上述实验结果与文献报道的人体卧床试验和动物实验结果基本一致[18-19]。从本实验结果看，胃窦肌层Cox-2表达异常和血清SS及VIP浓度变化可能在大鼠胃窦失重性应激损伤及应激修复过程中发挥重要作用，对该变化的机制进行探讨对失重训练和航天飞行工作具有重要意义。

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