互叶白千层愈伤组织诱导及植株再生

□王小敏，莫昭展* ，吴 敏

（玉林师范学院 生命科学与生物技术学院，广西 玉林 537000）

互叶白千层愈伤组织诱导及植株再生

□王小敏，莫昭展* ，吴 敏

（玉林师范学院 生命科学与生物技术学院，广西 玉林 537000）

本文报导了互叶白千层从无菌种子苗叶片诱导愈伤组织到植株再生的研究结果.实验表明：以继代代数不同的无菌苗叶片为诱导材料，在MS基本培养基中添加TDZ0.4mg/L+2,4-D0.4mg/L的第五代继代苗诱导效果较好，愈伤组织诱导率达100%. 在互叶白千层愈伤组织分化阶段，在MS基本培养基中，激素组合筛选中以添加6-BA2.0mg/L+IAA2.5mg/L的分化效果较好，分化率高达94.53%. 在分化苗伸长生根阶段，以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.8mg/L +AC 0.1%的效果较为显著，苗平均高度9.4cm，苗最壮，根粗且壮.

互叶白千层；愈伤组织；诱导；分化；伸长与生根

互叶白千层的(Melaleuca ahemifolia)为桃金娘科薄子亚科下的白千层属互叶白千层低矮灌木树种[1]，主要分布于马来西亚、印度尼西亚、意大利、澳大利亚等国家[2]，目前在我国南方部分地区也有种植.互叶白千层具有较高的经济价值，从互叶白千层的茎和叶中经过水蒸气蒸馏而得的互叶白千层油具有强力杀菌作用，又具有温和的辛香，属天然香料，当前在农业杀菌剂、日用卫生制品、皮肤保健品、化妆品、食品香料、药品等行业中开始广泛试用[3].

由于互叶白千层的种子多为败育，发芽率低，且种间差异大，致使优良品种匮乏，制约了精油生产的量的提高[4].本文对互叶白千层植株嫩茎和嫩叶进行组织培养试验，可以对互叶白千层组织培养的进一步研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料的选取与处理

以MS+6-BA2.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT1.0mg/L为培养基，种子萌发的无菌苗为第一代苗，以45d为培养周期进行继代培养，以后每继代一次为一代.选取经种子萌发、长势健壮的无菌苗，剪取带叶及腋芽的茎段，去除顶端优势，以茎段1.5cm左右接种于培养基中，每瓶接入6个茎段，茎段插入培养基0.3cm深度.将培养好的试管苗，选取长势旺盛，叶色浓绿宽厚的叶片，在叶柄处剪断接入到不同的诱导培养基中，每瓶接入7片叶子.

1.2 实验方法设计

以MS作为基本培养基，然后根据不同的培养目的来添加不同的基本培养基和不同种类、浓度的各种激素，培养基的pH为5.6～5.8，光照培养室温度为24℃～25℃，光照强度1500～2000Lx，光照培养12h/d.

1.2.1 互叶白千层叶片诱导愈伤组织的设计

研究以MS为基本培养基，并添加不同浓度的6-BA、2,4-D和TDZ（见表1），分别接入继代代数不同的叶片，筛选出对愈伤组织诱导效果较好的配方和最适合作愈伤组织诱导的继代代数苗.以上每个浓度梯度接种8瓶，每瓶接入7片叶子进行培养，45d后统计愈伤组织的诱导率和愈伤组织的生长状况.

表1 叶片诱导愈伤组织培养基Table1 Media of callus induction from in vitro leaf

1.2.2 叶白千层愈伤组织的分化实验设计

研究以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、NAA、IAA和2,4-D（见表2），分别接入由不同方法诱导出的愈伤组织，筛选出比较适合愈伤组织分化的配方，和分化效果最好的继代苗.以上每个浓度梯度接种8瓶，每瓶接入6团1cm2大小的愈伤组织进行培养，45d后统计愈伤组织的分化率和分化苗的生长状况.

表2 愈伤组织分化培养基Table2 Media of callus differentiation

1.4.3 互叶白千层分化苗的伸长实验设计

研究以MS为基本培养基附加0.1%AC，并添加不同浓度的NAA、KT、IBA和6-BA（见表3），分别接入用不同方法诱导出的分化苗.以上每个浓度梯度接种8瓶，每瓶接入6丛分化苗，每丛2到3株小苗，45d后统计分化苗的伸长和生根情况.

表3 分化苗伸长生根培养基Table3 Medium of differentiated seedlings elongation and rooting

1.2.4 实验数据分析和统计方法

愈伤组织的长势是指愈伤组织的紧密适中程度、愈伤组织的褐化程度、愈伤组织的坏死程度、愈伤组织的颜色深浅程度，以+表示，+越多表示各方面越好.

无菌苗的长势是指分化苗或继代苗的健壮程度、芽长均匀程度、分化苗的紧密度适中程度、芽叶完整程度，以+表示，+越多表示各方面越好.

试验中的各数据均以平均值计算而得，生长状况以直接观察、比较记录差别.

2 结果与分析

2.1 互叶白千层叶片愈伤组织的诱导

表4 不同继代数幼苗叶片愈伤组织的诱导Table4 Leaf callus induction of different generation subculture seedlings

叶片接种到愈伤组织诱导培养基培养15d后观察，在添加有TDZ的培养基中接种的叶片边缘已经变厚，已经出现少许的愈伤组织，再培养15d，分化率已经达到了50%以上，其中TDZ与2,4-D组合的实验组中部分已达到85%以上的诱导率.到45d后统计分析得出表4的数据.研究分析各代继代苗两因素组合实验中，添加TDZ的效果较没有TDZ的效果明显好很多，诱导率高，且诱导出的愈伤组织长势也比没有添加TDZ的好，高浓度的TDZ诱导效果较低浓度的效果好.在6-BA和2,4-D与TDZ的组合中，2,4-D与TDZ组合较6-BA组合实验效果好.没有TDZ实验组中，6-BA与2,4-D的用量比与诱导的效果成正相关.不同继代代数苗对愈伤组织诱导效果影响也比较明显，在用同一种培养基培养中，继代代数越多越容易诱导出愈伤组织.

2.2 互叶白千层愈伤组织的分化

表5 不同继代代数苗愈伤组织的分化Table5 Callus differentiation of different generation subculture seedlings

愈伤组织在各分化培养基中培养45d后统计实验结果，结果显示激素的浓度变化引起的分化率的变化并没有呈现出一定的规律.由表5可以看出，IAA（2.5mg/L）和6-BA（2mg/L）对愈伤组织的分化效果最好，分化率分别为第三代87.19%、第四代90.30%、第五代94.53%，分化率虽然不是最高的，但是分化出的苗整齐性、生长情况较之其他给组实验都好.从不同继代苗间的差异可以看出，第三代苗的分化率较之其他两代苗的分化率要低，第三代苗的分化率并没有达到90%以上的，而第四、五代苗的分化率多数达到了90%以上，而第四、五代苗间比较并没有很明显的差别.

2.3 互叶白千层分化苗的伸长与生根

丛生芽接种在伸长生根培养基15d后，分化苗的整体平均高度已经可以达到3.5cm，苗的高度、长势相对比较整齐，处理间没有出现比较明显的生长上的差异，再培养15d后，苗的整体平均高度已经达到了7cm，此时的苗出现了较大的差异，部分长势好的苗已经达到了9cm以上，而长势差的还是在7cm左右且苗较弱，培养到45d统计分析，从表6可见在诱导时期和分化期出现的各继代苗间的差异在伸长期并没有显现.一定浓度的6-BA（2 mg/L）与较低浓度的NAA（0.1mg/L）对丛生芽伸长和生根作用效果不如与高浓度的NAA（0.8mg/L）作用效果好.一定浓度的6-BA（2 mg/L）与不同浓度的IBA主要体现在生根作用上，随着IBA浓度的上升，其组合对苗的伸长和生根作用越好.一定浓度的KT（1 mg/L）与NAA和IBA的组合中，其作用效果与6-BA的作用效果并没明显的差异，同样也是高浓度的NAA和IBA对苗的伸长和生根作用比低浓度的作用效果好.

表6 不同继代代数分化苗的伸长生根Table6 Elongation and rooting of different generation subculture seedlings

4 讨论与结论

本文报导了互叶白千层从愈伤组织诱导到植株再生的全过程，主要分为愈伤组织诱导、愈伤组织分化、分化苗伸长与生根三个阶段进行.

在愈伤组织芽诱导阶段，发现以添加了TDZ的愈伤组织诱导效果较好，其中TDZ与2,4-D组合诱导效果最好，这主要是TDZ既起到生长素作用，又起到分裂素作用效果有关[5]，2,4-D对愈伤组织的诱导效果最有效，两者组合起到了促进作用，故而诱导效果最佳.不同继代代数无菌苗对诱导愈伤也影响较大，在无菌苗继代5代内,代数越高诱导的效果越好，这可能是因为植株内激素积累的影响.

在愈伤组织的分化阶段，不同的激素配比对植物的生长是有差异的，其中最佳的配方是MS+IAA（2.5mg/L）+6-BA（2mg/L）的培养基.而不同继代代数诱导的愈伤组织在分化上差异并不是特别明显，并没有出现在诱导期那样因继代代数不同而出现明显的差异，可能是在植物体内积累的激素在形成愈伤组织的时候已经开始慢慢地被消耗掉，以至于在分化的时候不会出现较明显的差异.

在分化苗伸长阶段，一定浓度的6-BA（2 mg/L）与较低浓度的NAA（0.1mg/L）对丛生芽伸长和生根作用效果不如与高浓度的NAA（0.8mg/L）作用效果好；一定浓度的6-BA（2 mg/L）与不同浓度的IBA主要体现在生根作用上，这可能是因为IBA是生根粉的主要成分有关，可以促进植物的生根[6]，随着IBA浓度的上升，其组合对苗的伸长和生根作用越好.一定浓度的KT（1 mg/L）与NAA和IBA的组合中，其作用效果与6-BA的作用效果无明显的差异，同样也是高浓度的NAA和IBA对苗的伸长和生根作用比低浓度的作用效果好.以MS+6-BA2.0（mg/L）+NAA0.8(mg/L)培养基为较佳配方，形成的苗的、壮，苗均高较高，达9.6cm.由不同代数苗诱导而成的无菌苗在伸长阶段没有显示出一定有规律性的变化，这可能是由于经过了脱分化和再分化阶段本来积累在植物体内的激素已经消耗，或是对形成的新苗的生长没有明显影响.不同的植物生长调节剂的不同配比及不同浓度比例对不同生长阶段的植物的作用是不同的，正确的使用生长调节剂种类和浓度比例才能达到试验目的，既不至于实验失败而浪费材料与原料以及人力，也缩短了植物在工厂化的快繁周期. ■

[1]贾芬，黄宇翔，丁舒敏.香料植物互叶白千层的引种栽培及利用研究[J].福建省农科院学报，1996，11(1)：33-34.

[2]张燕君，古佛政.互叶白千层精油的组分及抗菌作用[J].广东林业科技，1998，14(2)：31-34.

[3]李晓林，梁国鲁，胡英浩，等.互叶白千层的扦插繁殖试验研究[J].西南园艺，2003，3(1)：16-18.

[4]张梅，幸世林.互叶白千层大棚引种育苗[J].林业实用技术，2003，(7)：21-22.

[5]徐晓峰，黄学林.TDZ：一种有效的植物生长调节剂[J].植物学通报，2003，20(2)：227-237.

[6]王玉英，高新一.植物组织培养技术手册[J]. 金盾出版社，2006.3，42-87.

【责任编辑 谢文海】

Induction of Callus and Regeneration in Melaleuca alternifolia

WANG Xiao-min，MO Zhao-zhan*，WU Min
(College of Life Science & Technology, Yulin Normal University, Yulin, Guagnxi 537000)

In this study, the callus induction of aseptic seedlings and the plantlet regeneration of Melaleuca alternifolia were reported． The results showed that the optimization callus induction media was MS medium add TDZ0．4 mg/L+2,4-D0．4mg/L used the fifth generation aseptic seedling and the induction rate achieved 100%．In the stage of callus differentiation, the best differential medium was MS medium supplied with 6-BA2．0mg/ L+IAA2．5mg/L and differentiation rate of callus reached 94．53%． The best medium for regenerated plantlets rooting was MS + 6-BA2．0mg/L+NAA0．8mg/L +AC 0．1% and the average of seedling height reached 9．4cm．The seedlings and roots were strongest than those in the other medium．

Melaleuca alternifolia; callus; induction; differentiation; elongation and rooting

Q945.5

A

1004-4671（2014）02-0059-05

2014-01-01

广西科技攻关项目（桂科攻0992011-13）。

王小敏（1979～），男，广西全州人，玉林师范学院 生命科学与生物技术学院博士，讲师，从事植物分子生物学教学研究；*

莫昭展，玉林师范学院生命科学与生物技术学院教授，博士，主要从事植物种质资源利用的教学与研究工作，E-mail: mzz19741028@163.com。