苜蓿组织培养中一种安全快捷的种子灭菌法

王春梅，张 茜，张怀山，朱新强，王晓力

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050）

草地与牧草

苜蓿组织培养中一种安全快捷的种子灭菌法

王春梅，张 茜，张怀山，朱新强，王晓力

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050）

文章比较了0.1%升汞+10%NaClO+70%乙醇；10%NaClO+70%乙醇；10%NaClO+70%乙醇+1:15洁尔灭等不同消毒方法对苜蓿种子的灭菌效果，并分析了1/2 MS培养基和滤纸+1/2 MS培养液两种萌发介质对萌发率、污染率、生长时间的影响。结果表明：0.1%升汞+10%NaClO+70%乙醇和10%NaClO+70%乙醇+1:15洁尔灭的消毒方法污染率最低，且后一种方法对操作人员相对安全；滤纸+1/2 MS培养液的发芽率和幼苗生长速度较快，污染率也较低。综合效果表明：10%NaClO+ 70%乙醇+1:15洁尔灭与1/2 MS培养液+滤纸的组合安全快捷，效果最佳。

苜蓿；组织培养；安全；快捷

紫花苜蓿是优良的豆科牧草。紫花苜蓿适应性高、产量好、营养丰富，粗蛋白含量可达18%～26%，其他如矿物质、维生素的含量也很高，素有“牧草之王”的美称［1］。作为饲料牧草，在全世界种植面积高达3 300万hm2，在畜牧业中占有举足轻重的地位［2］。但是苜蓿经过多年人工栽培驯化，大多数抗逆性较差。尤其是近年来受全球气候变化和人口不断增长的影响，草场盐碱化程度日益加重，牧草产量迅速降低，需要培育耐盐抗旱苜蓿品种［3］。为了获得耐盐碱抗干旱更好的品种，我国许多研究机构对其再生体系做了大量研究［5-6］。分子标记辅助选育和转基因等手段为有效提高苜蓿抗逆性提供了新的选择。苜蓿转基因育种的关键之一是组织培养与植株再生。为了利用苜蓿种子获得组织培养外植体，本研究比较分析了3种消毒方法对苜蓿种子的灭菌效果，筛选出了一种适合苜蓿种子的安全快速的消毒方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

“中兰1号（Medicago Sativa cv.Zhonglan No.1）”紫花苜蓿由中国农科院兰州畜牧研究所提供。

1.2 培养基与灭菌方法

1/2MS培养基，滤纸+1/2MS培养液；pH值5.8，121℃高压灭菌锅灭菌20 min。

1.3 消毒处理

挑选籽粒饱满的成熟肾形苜蓿种子，先用流水进行冲洗，去掉泥沙，之后用去离子水清洗3遍，放入去离子水中浸泡过夜后进行种子消毒处理。处理1：以传统的升汞为主的灭菌方法为基础，0.1%升汞10 min+10% NaClO 2 min+70%乙醇 60 s；处理 2：去掉升汞，10% NaClO 5 min+70%乙醇60 s；处理3：添加新洁尔灭，10% NaClO 2 min+70%乙醇 60 s+1:15新洁尔灭（苯扎溴铵）5 min。

1.4 种子萌发

消毒后的种子分别置于1/2 MS培养基和1/2 MS培养液+滤纸两种培养介质上进行萌发。

1.5 愈伤组织培养

将各处理苜蓿外植体（下胚轴）接种于添加2.5 mg/L 2，4-D和0.5 mg/LKT的MS培养基，在25℃条件下暗培养3周后观察愈伤组织的生长情况，并做好统计。

2 结果与分析

2.1 不同培养介质和消毒方法对萌发率的影响

如图1所示，苜蓿种子在1/2 MS培养基中3种消毒方式的萌发率分别为90.3%，90.7%，91.7%；在滤纸+1/2 MS培养液中3种消毒方式的萌发率分别为92.0%，93.0%，92.3%。可见，消毒方式对种子萌发率没有明显影响，而滤纸+1/2 MS培养液的处理比1/2 MS提高了萌发率。

图1 不同培养介质和消毒方法对萌发率的影响

2.2 不同培养介质和消毒方法对幼苗生长时间的影响

如图2所示，苜蓿种子在1/2 MS培养基中长至可做外植体的无菌苗，即根长2～3 cm、子叶张开、出现第一片真叶的时间，在3种消毒处理下均为4 d。而滤纸+1/2 MS培养液中3种消毒方式的时间均为3 d，时间较短。

图2 不同消毒方式下培养无菌苗所需时间

2.3 不同消毒方式对污染率和出愈率的影响

由表1可见，处理1中细菌和真菌污染率分别为1.3%、0.7%，出愈率90.8%；处理2中细菌和真菌污染率分别为3.0%、4.3%，出愈率85.8%；处理3中细菌和真菌污染率分别为1.7%、1.0%，出愈率89.6%。

表1 不同消毒方式对污染率和出愈率的影响

3 讨论

低浓度的Hg2+（升汞）可与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性，酶失活，但也是一种剧毒的重金属盐杀菌剂，对操作人员有害，且废弃液对环境中的水安全存在很大的安全隐患［7］。新洁尔灭［8］（苯扎溴铵）是阳离子表面活性剂类广谱杀菌剂，能改变细菌胞浆膜通透性，使菌体胞浆物质外渗，阻碍其代谢而起杀灭作用，0.1%以下浓度对皮肤无刺激性。通常用于手术前皮肤消毒，粘膜和伤口消毒，手术器械消毒。本研究结果发现，用医用消毒剂新洁尔灭代替升汞与乙醇、次氯酸钠结合的方式与升汞一样能起到很好的灭菌效果，比只用乙醇、次氯酸钠消毒效果好，消毒时间短，且对人体相对安全。

在3种不同处理方式下，接种在滤纸+1/2 MS培养液上的苜蓿种子萌发率均比接种在1/2MS培养基上的要高，且能缩短成苗时间。其原因可能是：苜蓿种子的萌发需要水分与氧气，将种子接种于加有培养液的滤纸上，可以充分保证种子萌发提供的氧气与水分，促进萌发。直接接种于培养基中，由于培养 基是果冻状胶体，种子吸水相对困难，且可能使接触面接触不到空气影响萌发率。

因此，综合上述分析，苜蓿组织培养中种子的萌发和消毒工作，可以采用滤纸+1/2 MS培养液作为培养基和10%NaClO 2 min+70%乙醇60 s+1:15新洁尔灭5 min消毒结合的方式最佳，也可适当调整应用于其他植物的种子消毒。

［1］杨培志，陈小燕，赵锁柱，等.中国苜蓿繁育概述［J］.牧草科学，2004（2）：81-84.

［2］李望丰，吕德扬，刘艳芝，等.诱导苜蓿胚性愈伤组织分化和再生［J］.吉林农业科学，2002，27（2）：15-16.

［3］李取生，宋玉祥，赵春生.吉林西部草地盐碱化治理对蕞研究［J］.农业系统科学与综合研究,2001，l7（4）：304-309.

［5］王锦.紫花苜蓿植物学特征及基因工程研究现状［J］.农家科技，2012（8）：139.

［6］桂枝，高建明.我国苜蓿育种的研究进展［J］.天津农学院学报，2003，10（1）：37-41.

［7］何瑞，汤行春.生物学实验室升汞污染的解决方案［J］.生物学通报，2010，45（2）：49-50.

［8］晓芳，董开忠，王冬梅，等.新洁尔灭对三种细菌的抑菌效果研究［J］.西北民族大学学报：自然科学版，2009，30（1）：64-66.

A Safe and Fast Sterilization for Alfalfa Seed in Tissue Culture

WangChun-Mei，ZhangQian，WangXiao-Li
（Lanzhou Institute ofHusbandryand Pharmaceutical Sciences ofCAAS，Lanzhou 730050，China）

Comparison effect of different seed sterilization methods on alfalfa as follows：0.1%HgCl2+10%NaClO+70%ethanol；10%NaClO+70%ethanol；and 10%NaClO+70%ethanol+1:15 bromogeramine.Meanwhile，analyzingthe effect of1/2 MSculture medium and filter paper+1/2 MS solution on germination rate，pollution rate and growth time of alfalfa.The results showed that pollution rate was the lowest under both 0.1%HgCl2+10%NaClO+70%ethanol and 10%NaClO+70%ethanol+1:15 bromogeramine disinfection method；moreover，the later method was a relativelysafe method for operatingpersonnel.The germination rate and seedling growth speed were higher under filter paper+1/2 MS medium than 1/2 MS culture medium，while the pollution rate was lower.So，the safe and fast combination method is 10%NaClO+70%ethanol+1:15 bromogeramine+filter paper+1/2 MS solution.

alfalfa；tissue culture；safe；rapid

S54

A

2095-3887（2014）05-0038-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.011

2014-07-31

国家自然科学基金项目（31201841）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（1610322013011）；公益性行业（农业）科研专项（201203042）

王春梅（1981-），女，助理研究员。

王晓力，女，副研究员。