丹皮酚对血管性认知障碍小鼠认知功能的保护作用

王浩，耿赵铭，呙登俊，胡智伟，王百辰

（1.浙江省立同德医院 神经内科，浙江 杭州 310012；2.潍坊医学院 临床医学系，山东 潍坊 261053）

丹皮酚对血管性认知障碍小鼠认知功能的保护作用

王浩1，耿赵铭2，呙登俊1，胡智伟1，王百辰1

（1.浙江省立同德医院 神经内科，浙江 杭州 310012；2.潍坊医学院 临床医学系，山东 潍坊 261053）

目的：探讨丹皮酚对血管性认知障碍（VCI）小鼠认知功能及海马神经元损伤的影响。方法：雄性C57BL/6小鼠60只，随机分为假手术（Sham）组、模型（VCI）组、丹皮酚（Pae）低、中、高剂量治疗组，每组12只。采用双侧颈总动脉结扎（2VO）制备小鼠反复缺血再灌注VCI模型，Morris水迷宫检测小鼠的认知功能，尼氏染色观察小鼠海马神经元的形态学变化，比色法检测海马SOD活性、MDA和NO含量的变化。结果：VCI小鼠认知功能下降（P＜0.01），海马CA1区神经元变性坏死，MDA和NO含量增加，SOD活性降低（P＜0.01）；丹皮酚中、高剂量治疗可显著提高VCI小鼠的学习记忆能力，减少VCI所致的海马CA1区神经元死亡，并降低MDA和NO含量，升高SOD活性（P＜0.05或P＜0.01）。结论：丹皮酚可有效增强VCI小鼠的认知功能，并改善海马神经元病理改变，可能与其抗氧化应激有关。

认知障碍，血管性；抗氧化；海马；丹皮酚；小鼠

血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是指各种血管性因素引起的不同程度的认知障碍综合征，发病率高，起病隐匿并且进行性加重，严重影响生活质量[1-2]。VCI与缺血性脑血管病有关，长期慢性脑灌注不足可引起脑组织病理生理改变，进而出现系列功能障碍。目前主要是通过改善循环、促进代谢、增强神经传递等改善患者症状，但仍缺乏特异有效的治疗药物[3]。而中药及其活性成分在防治脑缺血损伤及认知损害等方面显示出良好效果，成为研究热点[4]。丹皮酚（paeonol，Pae）是一种中药单体，具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤及抗心律失常等药理作用[11]。本研究旨在观察Pae对VCI小鼠的神经保护作用，并初步探讨其保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 雄性C57BL/6小鼠60只，体质量22～26 g，由浙江省实验动物中心提供，动物合格证号：0002868，动物许可证号：SCXK（浙）2003-0001。随机分为假手术（Sham）组，血管性认知障碍模型（VCI）组，Pae低、中、高剂量治疗（分别为Pae-L、Pae-M、Pae-H）组，每组12只。

1.2 实验试剂 Pae（Pae注射液：每支10 mg/2 mL，纯度99%，由上海第一生化药业有限公司提供）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物研究所。

1.3 模型建立及给药方法 采用反复结扎双侧颈总动脉（CCA）造成缺血再灌注损伤（2VO）建立小鼠VCI模型[6-7]。采用10%水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，钝性分离双侧CCA，用动脉夹夹闭双侧CCA造成脑缺血，夹闭10 min，再灌注20 min，反复3次，缝合切口，术后行抗感染治疗。Sham组只行CCA分离，不夹闭血管。治疗组术后第1天分别开始腹腔注射10、20、40 mg/kg Pae，每日1次，共28 d；而Sham组和VCI组分别给予等量0.9%氯化钠溶液注射。模型筛选标准：排除术后有明显运动障碍的小鼠，进行Morris水迷宫训练，取第5天逃避潜伏期进行计算，公式为：（测试小鼠逃避潜伏期-对照组小鼠平均逃避潜伏期）/测试小鼠逃避潜伏期，＞20%为痴呆（其中20%～30%为轻度，30%～40%为中度，＞40%为重度），＜20%者剔除。

1.4 小鼠学习记忆能力测定

1.4.1 定位航行实验：实验前将小鼠放入水中进行适应性训练。术后28 d各组小鼠开始行Morris水迷宫实验。实验历时5 d，每天训练1次，记录小鼠寻找并爬上平台的时间即逃避潜伏期；如果小鼠在120 s内未找到平台，由实验者将其引至平台，记为120 s。每只小鼠每天分别从4个不同象限放入水中，每个象限各放入1次，计算每天逃避潜伏期的平均值。

1.4.2 空间探索实验：第6天撤除平台，任选一个入水点放入小鼠，测量120 s内：①小鼠在目标象限和其他象限的游泳时间；②穿越目标（原平台）次数[8-9]。

1.5 生化指标检测 行为学测试结束后，每组6只小鼠断头取脑，在冰上迅速分离海马组织，制成10%组织匀浆，4 ℃ 3 000 r/min，离心10 min，取上清液，根据试剂盒说明书，测定海马组织SOD活性及MDA和NO的含量。

1.6 病理学观察 每组另6只小鼠麻醉后行心脏灌流，冰预冷0.9%氯化钠溶液快速冲洗后序贯以4%多聚甲醛灌注，断头取脑，4%多聚甲醛后固定24 h，30%蔗糖脱水3 d，脑组织沉底后用冰冻切片包埋剂（OCT）包埋，进行冰冻切片（10μm），常规尼氏染色，在显微镜下观察海马CA1区锥体神经元形态学改变。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析。实验数据以±s表示，组间均数比较用重复测量方差分析，两两比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pae对小鼠认知功能的影响

2.1.1 定位航行实验：随着训练次数增多，各组小鼠逃避潜伏期均有不同程度缩短。与Sham组相比，VCI组小鼠的逃避潜伏期明显延长（P＜0.01）；而与VCI组相比，Pae-M组、Pae-H组小鼠逃避潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 各组小鼠逃避潜伏期比较（n=12，±s，s）

表1 各组小鼠逃避潜伏期比较（n=12，±s，s）

与Sham组比：aP＜0.01；与VCI组比：bP＜0.05，cP＜0.01

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天Sham组32.06±16.8325.32±14.3320.46±10.5613.43±9.35 9.32±3.91 VCI组80.34±21.50a75.14±9.63a71.21±11.59a65.85±7.32a59.56±9.73a Pae-L组60.86±19.6555.21±11.4148.96±12.6140.28±11.5933.21±8.91 Pae-M组45.21±13.58b37.25±11.37b30.49±8.44b23.25±6.41b20.38±7.25b Pae-H组42.85±14.47b30.25±9.86c26.19±9.37c17.85±5.78c13.51±4.66c

2.1.2 空间探索实验：与Sham组相比，VCI组穿越目标象限时间明显缩短（P＜0.01），穿越平台次数明显减少（P＜0.01）；与VCI组相比，Pae-M组、Pae-H组穿越目标象限时间明显延长，穿越平台次数明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

2.2 Pae对海马中SOD活性及MDA和NO含量的影响与Sham组相比，VCI组小鼠海马中SOD活性明显降低（P＜0.01），MDA和NO含量显著升高（P＜0.01）。与VCI组相比，Pae-M组、Pae-H组能够显著升高小鼠海马SOD活性，并降低MDA和NO含量（P＜0.05或P＜0.01）。见表3。

2.3 Pae改善小鼠CA1区海马神经元损伤 Sham组CA1区海马锥体神经元数目多，排列整齐且紧密；VCI组小鼠海马神经元呈现出典型的神经病理性改变，神经元密度显著减少（P＜0.01），形态不规则，着色不均匀，排列稀疏，并且尼氏小体减少或消失。而与VCI组比较，Pae-M组、Pae-H组的海马神经元损伤减轻（P＜0.05或P＜0.01），并且排列较整齐，层次较清楚，尼氏小体尚存在（见图1和表4）。

表2 各组小鼠空间探索实验结果比较（n=12，±s）

表2 各组小鼠空间探索实验结果比较（n=12，±s）

与Sham组比：aP＜0.01；与VCI组比：bP＜0.05，cP＜0.01

组别穿越目标象限时间（s）穿越平台次数Sham组22.37±9.20a8.35±2.56 VCI组10.75±4.92a2.13±0.96a Pae-L组13.83±5.17a3.69±0.85 Pae-M组17.43±5.95b4.65±1.52b Pae-H组19.37±4.99c6.81±1.63c

表3 各组小鼠海马组织SOD活性、MDA和NO含量比较（n=6，±s）

表3 各组小鼠海马组织SOD活性、MDA和NO含量比较（n=6，±s）

与Sham组比：aP＜0.01；与VCI组比：bP＜0.05，cP＜0.01

组别SOD（U/mg prot）MDA（μmol/g prot）NO（μmol/g prot）Sham组298.26±62.151.38±0.44a8.82±3.22 VCI组190.85±54.33a2.65±0.51a11.95±3.21a Pae-L组202.17±76.322.21±0.92a10.76±4.59 Pae-M组235.89±58.36b1.93±0.85b10.16±2.57b Pae-H组272.71±71.12c1.55±0.62b9.02±2.35b

图1 Pae对小鼠海马CAl区锥体神经元损伤的影响（尼氏染色，×400）

表4 各组小鼠海马CA1区神经元密度比较（n=6，±s）

表4 各组小鼠海马CA1区神经元密度比较（n=6，±s）

与Sham组比：aP＜0.01；与VCI组比：bP＜0.05，cP＜0.01

组别神经元密度（×103cells/mm2）Sham组1.28±0.25aVCI组0.57±0.14aPae-L组0.62±0.23aPae-M组0.86±0.29bPae-H组1.02±0.28c

3 讨论

反复脑缺血再灌注以及长期慢性脑灌注不足是造成VCI的主要原因，而认知功能障碍则是其主要的临床症状[1-2]。本研究采用反复结扎小鼠双侧CCA建立VCI模型，脑组织损伤明显，并造成学习记忆障碍，较好地模拟了VCI病程[6-7]。本实验行为学结果显示，术后28 d模型组小鼠出现明显的学习记忆障碍，表现为逃离潜伏期的延长和在目标象限中游泳时间的缩短以及穿越平台次数的减少。海马是大脑的重要结构之一，是脑内参与记忆贮存功能的重要部分，对缺血、低氧非常敏感，也是VCI研究中涉及最多的脑区之一[5]，本实验针对海马进行尼氏染色，结果发现海马CA1区锥体细胞变性、坏死，神经元密度降低，进一步证明造模成功。

Pae是从毛茛科植物牡丹皮、萝藦科植物徐长卿的全草等中提取出的小分子酚类单体，呈白色针状结晶，是一种天然抗氧化剂，其药理作用十分广泛，具有良好的应用前景和临床价值[11-14]。研究表明Pae能够通过清除氧自由基、抗脂质过氧化、增加脑组织血流量、增加侧支循环、抑制Ca2+超载、抗炎等减轻脑缺血再灌注损伤[16-17]，并且能抑制阿尔茨海默病大鼠神经元凋亡，改善糖尿病大鼠认知障碍[18-20]，还能调节小胶质细胞介导的炎症[15]。通过本研究发现Pae治疗后小鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短，在目标象限停留时间以及穿越平台次数显著增多，并且抑制海马CA1区锥体细胞变性、坏死，改善神经元密度的降低，提示Pae具有改善认知功能的作用。结合国内外研究报道，提示丹皮酚可能具有治疗脑疾病的应用前景。

VCI与脂质过氧化、氧自由基释放、Ca2+超载、细胞凋亡和炎症反应等有关，多种机制相互影响、促进，加重脑组织损伤，而自由基大量生成是神经元损伤的主要因素之一[1-3，10]。本实验发现Pae治疗可明显降低海马组织MDA、NO含量，提高SOD活性，表明Pae具有清除脑组织自由基，减少脂质过氧化，从而起到保护神经元的作用。

综上所述，通过本次实验发现Pae治疗可明显改善VCI小鼠的认知功能，降低海马组织MDA、NO含量，提高SOD活性，并且改善海马CA1区神经元损伤，其作用机制可能与减轻海马区的氧化应激水平有关。当然针对Pae改善VCI小鼠认知功能的具体机制仍需要进一步研究。

[1] Moorhouse P, Rockwood K. Vascular cognitive impairment: current concepts and clinical developments[J]. Lancet Neurol, 2008, 7(3): 246-255.

[2] Thal DR, Grinberg LT, Attems J. Vascular dementia: different forms of vessel disorders contribute to the development of dementia in the elderly brain[J]. Exp Gerontol, 2012, 47(11): 816-824.

[3] Baskys A, Cheng JX. Pharmacological prevention and treatment of vascular dementia: approaches and perspectives[J]. Exp Gerontol, 2012, 47(11): 887-891.

[4] 李瑞奇, 白明, 苗明三. 中药活性成分防治脑缺血特点分析[J]. 中医学报, 2013, 28(8): 1184-1187.

[5] Deng W, Aimone JB, Gage FH. New neurons and new memories: how does adult hippoca-mpal neurogenesis affect learning and memory[J]. Nat Rev Neurosci, 2010, 11(5): 339-350.

[6] Jiwa NS, Garrard P, Hainsworth AH. Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review[J]. J Neurochem, 2010, 115(4): 814-828.

[7] 曲娴, 李春颖, 苏畅, 等. 碱性成纤维细胞生长因子对血管性痴呆小鼠学习记忆及海马Calbindin-D28K表达的影响[J]. 中华医学杂志, 2010, 90(31): 2219-2222.

[8] 胡意员, 周利飞, 何金彩, 等. 长期高脂饮食对小鼠认知功能及情绪的影响[J]. 温州医学院学报, 2013, 43(4): 241-244, 248.

[9] 赵惠玲, 丁茂超, 胡斯旺, 等. 针刺对AlCl3致痴呆大鼠空间记忆障碍的改善作用[J]. 温州医学院学报, 2011, 41(1): 10-12.

[10] Gupta S, Sharma B, Singh P, et al. Modulation of transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1) and norepinephrine transporters (NET) protect against oxidative stress, cellular injury, and vascular dementia[J]. Curr Neurovasc Res, 2014, 11(2): 94-106.

[11] 杨正生, 彭振辉, 姚青海, 等. 丹皮酚的药理作用研究进展[J]. 中国药物与临床, 2011, 11(5): 545-547.

[12] Li H, Xie YH, Yang Q, et al. Cardioprotective effect of paeonol and danshensu combinati-on on isoproterenol-induced myocardial injury in rats[J]. Plos One, 2012, 7(11): e48872.

[13] Hu S, Shen G, Zhao W, et al. Paeonol, the main active principles of paeonia moutan, ameliorates alcoholic steatohepatitis in mice [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 128(1): 100-106.

[14] 张金艳, 赵乐, 余学钊, 等. 丹皮酚对健康和高血脂大鼠肾动脉和冠状动脉的舒张作用[J]. 中国新药杂志, 2013, 22 (20): 2414-2417.

[15] Tseng YT, Hsu YY, Shih YT, et al. Paeonol attenuates microglia-mediated infammation and oxidative stress-induced neurotoxicity in rat primary microglia and cortical neurons [J]. Shock, 2012, 37(3): 312-318.

[16] 杨青, 武继彪, 张岫美. 丹皮酚对大鼠脑缺血再灌注损伤炎性细胞因子的作用[J]. 中国生化药物杂志, 2010, 31(2): 11l-113.

[17] Wu JB, Song NN, Wei XB, et al. Protective effects of paeonol on cultured rat hippocampal neurons against oxygenglucose deprivation-induced injury[J]. J Neurol Sci, 2008, 264(1-2): 50-55.

[18] 周军, 周丽, 侯德仁, 等. 丹皮酚对Aβ诱导的AD模型大鼠脑细胞凋亡因子的影响及作用机理[J]. 中药材, 2011, 34 (5): 758-762.

[19] Liu J, Feng L, Ma D, et al. Neuroprotective effect of paeonol on cognition deficits of diabetic encephalopathy in streptozotocin-induced diabetic rat[J]. Neurosci Lett, 2013, 549: 63-68.

[20] Zhong SZ, Ge QH, Qu R, et al. Paeonol attenuates neurotoxicity and ameliorates cognitive impairment induced by d-galactose in ICR mice[J]. J Neurol Sci, 2009, 277(1-2): 58-64.

（本文编辑：吴飞盈）

Protective effects of paeonol on cognitive dysfunctions in mice with vascular cognitive impairment

WANG Hao1, GENG Zhaoming2, GUO Dengjun1, HU Zhiwei1, WANG Baichen1.
1.Department of Neurology, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou, 310012; 2.Department of Clinical Medicine, Weifang Medical College, Weifang, 261053

Objective:To investigate the effects of paeonol on cognitive dysfunctions and hippocampal neuronal injury of vascular cognitive impairment (VCI) mice.Methods:Sixty C57BL/6 mice were randomly divided into sham opertated group, the VCI group and the paeonol treated groups (low, medium and high dose). The VCI models were dupilicated by the bilateral common carotid artery occlusion (2VO). The cognitive impairments were observed by Morris water maze. The contents of MDA, SOD and NO in hippocampus were determined spectrometrically. The hippocampal neuron injuries in the CA1 region were detected by nissle staining.Results:VCI induced the decreased cognitive function and neuron injury in the hippocampal CA1 region (P＜0.01). And MDA and NO contents were signifcantly increased, whereas SOD activity was dramatically decreased after VCI (P＜0.01). Compared with VCI model goup, the medium and high dose of paeonol treatment signifcantly improved cognitive impairments and reduced pathological changes in hippocampal CA1 region (P＜0.05, P＜0.01). In additon, the medium and high dose of paeonol treatment markedly improved SOD activity, decreased MDA and NO contents in hippocampus (P＜0.05, P＜0.01).Conclusion:Paeonol can improve cognitive impairments and neuronal injury in VCI mice, which may be related to the increased antioxidative ability of brain tissue.

cognitive impairment, vascular; antioxidant; hippocampus; paeonol; mice

R741

A

1000-2138（2014）10-0708-04

2014-04-09

浙江省自然科学基金资助项目（Y2110679）。

王浩（1982-），男，山东枣庄人，主治医师，硕士。

胡智伟，主任医师，Email：huzhiwei2008@163.com。