冷冻保存对和田羊精液品质的影响

阿布力克木·提力瓦尔迪，王旭光，艾合买提江·吐尔逊，吐尔逊别克·阿得力别克，热比娅，麦地娜，阿布力孜·吾斯曼

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052；2.新疆维吾尔自治区畜牧总站）

冷冻保存对和田羊精液品质的影响

阿布力克木·提力瓦尔迪1，王旭光1，艾合买提江·吐尔逊1，吐尔逊别克·阿得力别克2，热比娅1，麦地娜1，阿布力孜·吾斯曼1

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052；2.新疆维吾尔自治区畜牧总站）

对和田羊精液进行冷冻保存，以比较冷冻对和田羊精子获能、质膜完整性和顶体完整率的影响。结果表明：①冷冻保存对绵羊精子获能有一定的影响，解冻精子的获能比新鲜精子的获能数量显著增多（P<0.05）。解冻过程使得显示获能的B型精子的数量显著增加（P<0.05）。②冷冻使精子质膜破损，致使解冻精子无论是在质膜完整性还是在顶体完整率上都与新鲜精子存在较大差异，说明冷冻过程对精子膜结构造成了严重损伤。

和田羊；精液检查；冷冻保存；精子

和田羊是有悠久历史的地方优良品种，它是我国优良的地毯毛地方品种，属异质半粗毛短脂尾绵羊品种，善于长途跋涉觅食，有较强的抗病力。

绵羊精液的冷冻保存对于绵羊遗传资源的长期保存和辅助繁殖技术研究具有重要意义。准确、客观地评价精子的质量和受精能力是人工授精和体外受精技术成功的关键［1］。

目前，精液品质的主要检测指标有精液量、精子活力、精子密度、精子畸形率、顶体完整率、存活时间等。人们对精液品质的检测方法不断改善，进而对精液质量的评价也相应发生了变化，使得对冷冻-解冻后精液质量的评定更加科学、准确，以便于确切地反映精子的受精能力［2］。为此，本实验采用HOS-EY法和考马斯亮蓝染色法，研究了冷冻对和田羊精子获能、质膜完整性及顶体完整率的影响，以期为提高绵羊精液品质提供可靠的科学依据，也为绵羊冷冻保存技术在生产实践中的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

氯化钠，三氨基甲烷，CTC染料，戊二醛，PBS试剂，香柏油，无色指甲油，甘油，考马斯亮蓝R-250，伊红低渗液。

正置荧光显微镜，pH测仪，离心机，电子天平，计数板，显微镜。

精液稀释液基础液包含：葡萄糖，蔗糖，青霉素，链霉素，柠檬酸钠（国产，化学纯），新鲜卵黄。

1.2 方法

1.2.1 精液的采集和要求 以2只体重相近、膘情中等、体质健康正常、性欲旺盛、年龄在2～3岁的和田羊公羊作为实验动物。利用假阴道法采精。精液采出后，立即于37℃下常规品质检查，要求原精液无异味，色泽乳白色，云雾状；原精液活力不低于0.8，密度为“密”级。

1.2.2 精液的稀释和平衡 在精液常规品质检查完成后，将符合要求的新鲜精液根据活率和密度按1∶3～1∶4的比例稀释。冷冻稀释液与精液稀释混匀后在室温下，用0.25 mL的塑料细管分装并封口，裹8～10层纱布置于4℃冰箱中平衡2～3 h。

1.2.3 精液的冷冻保存 将平衡好的细管精液置于自制装有液氮的冷冻泡沫盒内（细管精液距离液氮表面2.0～2.5 cm，温度在-80～-110℃之间）熏蒸，5～7 min后投入液氮保存。

1.2.4 精液解冻 从液氮中取出细管精液，迅速平行地浸入39～40℃水浴中，轻轻摇动至融化（10～15 s），即备使用。

1.3 精子品质检测方法

1.3.1 精子活率及密度检测 将精液在37℃预热后置于显微镜下，在400倍下观察精子运动状态并评定精子

活率，原精活率0.8以上方可使用。用血细胞计数法计算精子密度。

1.3.2 精子获能测定 将100 μL新鲜原精分装于离心管中，1 600 r/min离心5 min，进行精液浓缩；而后加入约1.5 mL的PBS悬浮精子，1 600 r/min离心5 min，再洗涤2次，弃上清液。再加入1.5 mLPBS悬浮，取样15 μL并加入CTC染液15 μL，悬浮20 s再加3%戊二醛3.6 μL，取样10 μL滴到载玻片上，加盖玻片后用无色指甲油封片观察。精子获能的判定：以CTC荧光染色法观察精子获能情况。经CTC荧光染色后精子分为3种类型即B、F和AR型。B型精子为已获能精子，其特点是顶体帽仍然存在，但在顶体后区出现一条暗淡的荧光区带；F型为未获能精子，其顶体帽完整，整个顶体布满黄绿色荧光；AR型精子为顶体反应精子，顶体帽缺少，整个精子头部显示淡绿色或无荧光，见图1。

图1 B、F、AR型精子示意图

1.3.3 精子质膜检测 取新鲜或冷冻精液0.1 mL加入1 mL低渗液中，混匀，放37℃水浴后，再加入伊红低渗液0.1 mL，混匀。2 min后取样置于光镜下观察精子头部着色和尾部肿胀情况，按以下4种精子类型进行统计，计算百分率。Ⅰ型为头红染（EY+）-尾不肿胀（HOS-）；Ⅱ型为头红染（EY+）-尾肿胀（HOS+）；Ⅲ型为头未染（EY-）-尾不肿胀（HOS-）；Ⅳ型为头未染（EY-）-尾肿胀（HOS+）。基于精子头部和尾部的形态学变化，4种精子类型分别提示，Ⅰ型是头膜和尾膜同时发生损伤的精子，Ⅱ型和Ⅲ型是膜损伤分别发生在头部或尾部的过渡型，Ⅳ型是头膜和尾膜都完整的活精子。

1.3.4 精子顶体检测 取50 μL精子稀释液加入1 mL 0.9%生理盐水中，10 000 r/min离心15 s（所有离心均是这样的标准）弃上清。加1 mL3.7%多聚甲醛／PBS后用加样器悬浮，在室温固定30 min，离心后弃上清。用500～800 μL悬浮后涂片，空气干燥用0.22%考马斯亮蓝G-250染色5 min。蒸馏水洗去染色后，空气干燥，进行观察。镜检200个以上精子。结果判断标准：①Ⅰ型：顶体完整，精子外型正常，着色均匀，顶体边缘整齐，有时可见清晰赤道板。②Ⅱ型：顶体经微膨胀，精子质膜疏松膨大。③Ⅲ型：顶体破坏，精子质膜严重膨胀受损，着色浅，边缘不整齐。④Ⅳ型：顶体完全脱落，精子核完全裸露。

计算公式：精子顶体完整率（%）=顶体完整精子数／200×100%

1.4 数据统计数据采用EXCEL及SPSS 19.0软件进行方差分析，

P>0.05时差异不显著；P<0.05时差异显著,P<0.01时差异极显著。

2 结果与分析

2.1 冷冻前后精子获能变化的比较

从表1可知，和田羊新鲜精子B型为41.5%，F型30.5%，AR型28.0%；而解冻精液则B型为56.0%，F型21.5%，AR型22.5%。由以上可以看出，解冻精液的B型精子的数量显著增加（P<0.05）。

表1 冷冻前后精子获能变化的比较

2.2 冷冻前后精子质膜变化的比较

绵羊精液冷冻-解冻过程对精子质膜完整性有严重影响。从表2可知，头膜损伤-尾膜完整的Ⅱ型精子发生率在冷冻过程中从（21.01±1.15）%增加到（38.33± 5.69）%（P＜0.01），头膜完整-尾膜损伤的Ⅲ型精子发生率从新鲜精液的（17.50±2.08）%减少到冷冻精液的（9.05±0.96）%（P＜0.05）。此外，在经冷冻保存后，头膜-尾膜均完整的Ⅳ型精子发生率和头膜-尾膜均损伤的Ⅰ型精子发生率分别显著减少和增多（P＜0.05）。

表2 冷冻前后精子质膜变化的比较

2.3 冷冻前后精子顶体完整率变化比较

从表3可知，新鲜精液和冷冻精液组的精子顶体完整率分别为（76.20±7.66）%和（51.67±4.87）%。冷冻精液的顶体完整率和精子活率与冷冻前比较均显著下降（P<0.05）。

表3 冷冻前后精子顶体完整率变化比较

3 讨论

3.1 冷冻保存对绵羊精子获能的影响

获能并不能产生一个可区分及稳定的激活状态的细胞群体，而是一个连续的去稳定的过程，最后会导致细胞死亡。当达到不稳定状态的临界水平时，精子展现出活动过度的运动性并且对一个适当的信号能做出反应而发生顶体反应，此点即可作为已获能的标志（陶勇等，1999）。获能一旦开始，随着膜功能渐进性恶化，去稳定的过程将会继续超出临界水平，直到精子不能够维持细胞的完整性。

金霉素荧光染色法（CTC）是根据精子不同获能状态进行染色，并可将精子分为B、F和AR等3种CTC荧光染色类型，但对未获能精子则没染色［3］。由Gillan等［4］研究发现，羊鲜精为18%（B）、61%（F）和21%（AR），而解冻精液则有66%（B）、7.2%（F）和26%（AR），解冻过程使显示获能的B型精子的数量增加，但对顶体反应的精子数量有很小的影响。本实验结果表明：解冻过程使得显示获能的B型精子的数量增加，这一结果与Gillan等的研究结果基本一致，表明冷冻保存能诱导精子的获能变化。

3.2 冷冻保存对绵羊精子质膜完整性的影响

由于冷冻保存过程中的物理和化学效应直接作用于精子质膜和顶体完整率，导致精子质膜的完整性不可避免地受到影响，因此阐明冷冻保存时精子质膜的完整性和顶体完整率对于评价精液品质有重要意义［5-6］。

吴裕伦等［7］用HOS-EY对人精子头膜和尾膜完整性进行检测，发现精子尾部肿胀率与精子活率呈现显著正相关，与精子死亡率呈现显著负相关，精子低温冷冻时，由于精子内外环境的剧烈改变，必然产生物理性或化学性的冷冻损伤。有关研究表明，当精子活率越高、死亡率越低时，精子尾部低渗肿胀率越高，提示精子尾膜的完整性越好。本实验结果表明：头膜损伤-尾膜完整的Ⅱ型精子发生率在冷冻组极显著增多（P＜0.01），提示精子头部或尾部的冷冻损伤是独立发生的，且头膜较尾膜易损伤；4种类型新鲜精液的精子发生率与冷冻前相比均有显著性差异（P<0.05），这表现在经冷冻保存后，头膜-尾膜均完整的Ⅳ型精子发生率比新鲜精液显著减少。头膜-尾膜均损伤的Ⅰ型精子发生率显著增多。这与朱伟杰等［8］采用HOS-EY对人解冻精子质膜完整性进行检测的研究结果相一致，这表明精子质膜在冷冻保存过程中受到一定的损伤。

3.3 冷冻保存对绵羊精子顶体完整率的影响

顶体完整率是反映顶体缺陷与否的重要指标。相关研究发现，即使是小卵形精子和梨形精子，只要其顶体形态正常，仍可以成功地与透明带结合［9］。精子冷冻保存时精子经历与冷冻保护剂孵育、降温冷冻、超低温贮存和解冻复温等过程，这些过程的化学和物理效应直接作用于精子，精子顶体不可避免地受到影响。本研究结果表明，新鲜精液和冷冻精液组的精子顶体完整率分别为（76.20±7.66）%和（51.67±4.87）%，表明冷冻精液的顶体完整率显著下降（P<0.05）。冷冻精液顶体完整率的降低与本实验使用的冷冻稀释液成分、降温速度、冷冻方法及解冻等有直接的关系。因此，在今后的绵羊精液冷冻过程中要特别注意以上因素，将冷冻过程对精子顶体的损伤程度降到最低，以提高冷冻精子顶体完整率。

4 小结

1）和田羊精子解冻后精子获能比率比新鲜精子获能比率高。解冻后获能的B型精子的数量增加。

2）精液冷冻使和田羊精子质膜破损，解冻后的精子无论是在质膜完整性还是在顶体完整率上都与新鲜精子有显著性差异。这说明冷冻过程对和田羊精子质膜结构有较大的损伤作用。

［1］张明，鲜红，朱庆，等.哺乳动物精子质量评定方法研究进展［J］.四川动物，2007（1）：19-22.

［2］乔利敏.动物精液质量检测方法研究进展［J］.中国畜牧兽医，2013，40（7）：153-157.

［3］唐军旺，张明，郑海英.用CTC荧光染色法检测添加肝素对牛精子体外获能的影响［J］.生物技术通报，2006，6：92-95.

［4］Gillan L，Evans G，Maxwell WM.Capacitation status and fertilityoffresh and frozen—thawed ram spermatozoa［J］.Reprod Fert and Dev，1997，9：181-187.

［5］徐振军，刘黎明，刘冰，等.低温保存对绵羊精子质膜完整性的影响［J］.黑龙江畜牧兽医，2012（1）：494-496.

［6］沈大庆，王沛涛，李强，等.冷冻干燥法对人精子DNA的影响［J］.中国医学生物技术，2008，3（1）：49-53．

［7］吴裕伦，陈在贤.低温冷冻对精子膜功能的影响［J］.中国优生与遗传杂志，2006，14（2）：95-96.

［8］朱伟杰，刘学高.冷冻保存对人类精子膜完整性的影响［J］.中国病理生理杂志，1997，13（6）：624-627.

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S826.3

A

2095-3887（2014）02-0019-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.006

2013-12-02

新疆维吾尔自治区高校科研计划科学研究重点项目（XJEDU2010I23）；国家自然科学基金项目（31160459）；新疆肉乳草食动物实验室资助

阿布力克木·提力瓦尔迪(1987-)，男，维吾尔族，硕士研究生。

阿布力孜·吾斯曼（1968-），男，维吾尔族，博士，副教授，硕导，从事动物繁殖与胚胎生物技术研究。