茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶在酸奶中的应用研究

张莉丽，韩 雪，张兰威，夏东海，马崇玉，冯 镇（.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨50030；.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨50090）

茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶在酸奶中的应用研究

张莉丽1，韩 雪2，*，张兰威2，夏东海1，马崇玉1，冯 镇1
（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

为了研究本实验室制备的谷氨酰胺转氨酶（TGase）的应用特性，采用两种不同的TGase添加工艺生产酸奶：第一种采用TGase交联乳后加热钝化酶活力，然后添加发酵剂制备酸奶；第二种采用活性TGase与发酵剂同时添加到乳中的方法生产酸奶。通过对比这两种酸奶和对照样品（未添加TGase）的发酵时间、质构变化、乳清析出量和感官评价，确定此酶在酸奶中的添加条件。结果发现活性TGase交联酸奶的坚实度、粘度、乳清析出量和感官评价都有很大的改善，并且确定此TGase最适添加量为30U/L。

谷氨酰胺转氨酶，酸奶，质构特性，感官评价

谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，EC2.3.2.13，R-glutaminyl-peptide：amnieγ-glutamyl-transferase，简称TGase）又名转谷氨酰胺酶，它通过诱导肽段之间ε（γ-谷氨酰）赖氨酸键作用，催化蛋白质分子内和分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间连接，以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，从而改善蛋白质的功能特性和结构，并能通过引入赖氨酸提高蛋白质的营养价值，生产出满足人们需求的高营养食品[1]，因此被誉为“21世纪超级黏合剂”。

酸奶具有良好的益生功能，赢得了广大消费者的青睐，但生产厂家为了提高其稳定性已经采取了一些方法改善其质地，如增加非脂固形物或/和蛋白质含量，或者添加一些凝胶物质。但是一些国家不允许添加稳定剂或可能产生毒性成分的添加剂，因此TGase已经被用来改善酸奶的凝胶特性和质地[2-4]。本课题组利用MgCl2胁迫提高了茂原链霉菌发酵生产TGase的产量[5]，并且通过分离纯化，得到了电泳纯的TGase，通过研究它的酶学性质发现，它比现有报道的链霉菌TGase具有更好的热稳定性和pH稳定性[6]。为了进一步研究此酶的应用特性，本文对比两种TGase添加工艺，即分别采用交联后钝化酶活力再发酵和与发酵剂同时添加活性TGase两种工艺生产酸奶，通过研究两种酸奶和对照样品（未添加TGase）的发酵时间、坚实度、粘度、乳清析出量和感官评价，确定此酶在酸奶中的添加条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷氨酰胺转氨酶 实验室自制；牛奶 哈尔滨市香坊农场；白砂糖 上海农丰实业有限公司一分公司；保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌 本实验室保存。

PB-10型酸度计 北京赛多利斯仪器系统有限公司；TAX-XT2i型质构分析仪（TPA） 英国Stable Micro Systems公司；DHP-927型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-40IC型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；3-30K型冷冻离心机 Sigma公司；高压均质机。

1.2 实验方法

1.2.1 凝固型酸奶的生产 工艺流程如下所示：

乳酸菌纯培养物→母发酵剂→生产发酵剂

↓

原料奶预处理→标准化→配料→均质→杀菌→冷却→加发酵剂→分装→保温发酵→冷却→后熟→凝固型酸奶。

1.2.2 酸奶的制备 工艺操作如下所示：

a.对照样品：发酵过程不加TGase，只接种发酵剂。

b.活性TGase交联酸奶：在添加发酵剂的同时，分别按照20、30、40、50、60U/L的浓度添加TGase，发酵后测量酸奶的各个指标。

c.TGase钝化酸奶：乳经杀菌冷却后分别按照20、30、40、50、60U/L的浓度添加TGase，在40℃反应2h，加热到95℃，保持5min，使酶钝化，加入发酵剂，发酵后测量酸奶的各个指标，与a、b的结果进行比较。

1.2.3 酸奶凝乳时间的确定 将对照样品、活性TGase交联酸奶和添加TGase后钝化酸奶分别在43℃保温发酵至pH4.5，记录发酵时间。

1.2.4 酸奶质构（TPA）的测评方法 酸乳凝固后放入冰箱，4℃冷藏，冷藏24h后，采用质构分析仪测量酸乳的坚实度、稠度、粘度、粘附性指数。TPA测定参数如下：测定前探头速度1.00mm/s；测定时探头速度1.00mm/s；测定后探头速度1.00mm/s；测定距离20mm；探头柱型AEC，盘径35mm；感应力Auto-5g；数据攫取速度200pps。

1.2.5 乳清析出量测定 乳清析出量即测定酸乳胶体脱水收缩作用的敏感性（Susceptibility to Syneresis，STS）：在6℃下将100mL酸乳小心倾入到一个120目不锈钢网筛中，2h后收集沥出的乳清，用100mL量筒量出体积[7]。计算公式如下：

1.2.6 感官评分 经过后熟的酸奶由5位食品专业研究生和6位普通消费者对产品的色泽、气味、滋味和组织状态进行评价，根据评分标准（见表1）评分，以100分制填写评分表，90～100分（很好）、70～80分（较好）、50～60（一般）、30～40（较差）、10～20（很差）。

2 结果与分析

2.1 TGase不同添加方式对凝乳时间的影响

当酸奶pH下降到4.5时，酸奶完全凝固。对照样品（TGase添加量为0U/L）和添加少量活性酶（20U/L和30U/L）酸奶样品的凝乳时间在245～260min之间，添加高浓度活性酶的酸奶样品凝乳时间延长（见图1）。这与Lorenzen[8]、Færgemand[9]和Ozer等[10]的研究结果一致。他们发现向酸奶中添加活性TGase会延长发酵时间。Færgemand等[9]认为酸奶中蛋白质交联影响了乳酸菌对低分子量肽的利用，抑制了乳酸菌生长，因此延长了发酵时间。但是本文的研究结果与Bönisch等[11]的发现不同，他们认为这种矛盾的结果是由于实验条件不同造成的。添加TGase后钝化酸奶的凝乳时间要远远超过对照样，随着酶添加量的增大，凝乳时间变化不明显。图1还表明，加酶后钝化与添加活性酶酸奶相比，前者的凝乳时间要远远大于后者。

图1 TGase不同添加方式对凝乳时间的影响Fig.1 Addition methods of TGase on the yogurt curding time

表1 感官评分标准Table 1 Sensitive evaluation

2.2 TGase不同添加方式对酸奶质构的影响

利用质构仪来测试酸奶的坚实度、稠度、粘度、粘附性指数。由表2可以看出，在活性TGase交联酸奶中，酶添加量越大，酸奶凝胶强度越大，酸奶越稠厚，同时，细腻度也越差；当活性TGase添加量达40U/L时，测得其坚实度、稠度、粘度、粘附性指数几乎为对照样品（TGase添加量为0U/L）的二倍。这表明，添加TGase导致乳中的蛋白质发生交联，从而增加产品的凝胶强度和粘度。Gauche等[12]认为质构改善是由于TGase交联蛋白形成ε-（γ-glutamyl）lysine造成的。由表2还可以看出，在添加等量TGase时，TGase钝化酸奶的坚实度、稠度、粘度、粘附性指数均低于活性TGase酸奶。当TGase添加量较小时，TGase钝化酸奶的坚实度、稠度、粘度和粘附性指数与对照样品差异不显著。只有当TGase的添加量达到60U/L以上时，才能明显提高酸奶的坚实度、稠度、粘度和粘附性指数。这与Sanli和Lorenzen等的研究结果一致，他们认为凝固型酸奶发酵过程中，活性TGase可以提高其凝胶强度[3，8]。

表2 两种酸奶质构分析对比Table 2 The contrasting texture of two kinds of yoghurt

2.3 TGase不同添加方式对乳清析出量的影响

TGase不同添加方式对酸奶乳清析出量影响的结果见图2。由图2可以看出，乳清析出量随着酶添加量增大而减小，这是由于TGase引发乳中的蛋白质发生永久交联，导致凝胶渗透性降低，最终使酸奶具有更紧密、稳定的微观结构，更多的自由水被锁在酸奶凝胶的网络中。当TGase添加量相同时，活性TGase交联酸奶的乳清析出量明显低于TGase钝化酸奶，这可能是由于钝化酸奶的蛋白质交联程度低于活性TGase交联酸奶造成的。

图2 TGase不同添加方式对乳清析出量的影响Fig.2 Addition methods of TGase on the whey syneresis

2.4 TGase不同添加方式对感官评价的影响

由图3可知，活性TGase交联酸奶实验中，TGase添加量较低（20U/L）的酸奶得分与对照组（TGase添加量为0U/L）差异不显著；TGase添加量在30U/L的酸奶评分最高，因为其凝乳结实，表面比较光亮，质地也较细腻，酸奶的香味浓重；而添加量过大（50、60U/L）的酸奶由于结构较松散、切面较碎、呈沙粒状，不容易被评委接受，因此得分较低。两种酸奶的对比可知，TGase被钝化酸奶的感官得分要低于活性TGase交联酸奶，只有添加量在40U/L的两个酸奶评分几乎相同。由以上结果可以发现，活性TGase交联酸奶中酶的最适添加量为30U/L，而TGase钝化酸奶，其最适添加量为40U/L。

图3 感官评价对比图Fig.3 Sensitive evaluation

3 结论

目前有很多提高凝固型酸奶稳定性的方法，包括添加乳粉，通过超滤或添加乳蛋白来提高乳中的蛋白质含量、添加一些稳定剂来控制酸奶的质构缺陷，从而提高酸奶的浓度和质地。目前的研究表明，TGase交联乳中蛋白是替代调节固形物或添加稳定剂的有效方法。本文通过向酸奶中添加TGase，并且采用交联后钝化和与发酵剂同时添加活性TGase两种工艺生产酸奶，结果发现活性TGase交联酸奶的坚实度、粘度、乳清析出量和感官评价有很大的改善，并且确定此TGase最适添加量为30U/L。另外，虽然添加TGase交联后再钝化的工艺也能改善酸奶的质构，但TGase的添加量较大；而且当TGase添加量过大时，感官评价分值很低。因此，TGase的添加方式为添加发酵剂的同时加入TGase，最适添加量为30U/L。

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Application of transglutaminase from Streptomyces mobaraense in yoghurt

ZHANG Li-li1，HAN Xue2，*，ZHANG Lan-wei2，XIA Dong-hai1，MA Chong-yu1，FENG Zhen1
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

In order to study the properties of transglutaminase prepared in the laboratory，two different addition techniques of TGase were compared.One was to add fermentation agent after crosslinking milk by TGase following inactivation TGase by heat treatment，the other was to add TGase and fermentation agent to milk at the same time.These adding conditions of TGase were determined by comparing the two kinds of yogurt and control samples（without TGase）.Fermentation time，texture changes，whey precipitation and sensory evaluation of yogurt were compared.Results showed that the firmness，viscosity，whey precipitation and sensory evaluation of the yogurt crosslinked by the active TGase were greatly improved，and the optimum adding amount of TGase was 30U/L.

transglutaminase；yogurt；textural properties；sensory evaluation

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0210-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.037

2013－12－18 *通讯联系人

张莉丽（1981－），女，博士，讲师，研究方向：蛋白质工程和发酵工程。

国家自然科学基金项目（31301545）。