屎肠球菌发酵特性及其功能性研究

夏 玉，郑 华，林 捷，徐国波（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

屎肠球菌发酵特性及其功能性研究

夏 玉，郑 华，林 捷*，徐国波
（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

探讨了分离自新疆酸奶疙瘩的一株屎肠球菌在乳制品应用中具有的潜在益生价值。通过测定滴定酸度、丁二酮、乙醛、游离氨基酸等指标，研究了屎肠球菌在脱脂乳中的发酵特性以及发酵乳上清液具有的抗氧化与抑菌功能。结果表明，屎肠球菌产酸、产香和降解酪蛋白能力强，37℃发酵24h，滴定酸度为123.55°T，丁二酮含量为12.31μg/mL，乙醛含量高达90.12μg/mL，游离氨基酸含量为331.92μg/mL，活菌数最高可达1.10×1010cfu/mL。发酵乳上清液对常见病原微生物有抑制作用，且抑菌物质具有热稳定性、较宽的pH范围、对蛋白酶敏感的特点，对羟自由基清除率为96.84%，超氧阴离子自由基清除率为31.33%，具有抗氧化能力。

屎肠球菌，发酵特性，抑菌，抗氧化

肠道益生菌是一类活的微生物，可帮助机体消化和抑制有害微生物的生长，有益于宿主的健康。屎肠球菌是肠道内的正常菌群，广泛存在于传统乳制品中，具有耐酸、耐热、肠道粘附能力强等特点，以及抑制病原菌、增强免疫力等作用[1-2]。研究表明，在乳制品中投放乳品株肠球菌对于传统奶酪成熟和香气的形成具有积极作用，通过蛋白水解与脂分解，柠檬酸盐代谢，产生芳香性挥发化合物[3]。肠道病原菌以及体内自由基失衡能够引发多种疾病，水解乳蛋白制备具有功能性的活性多肽已有诸多报道[4]，有研究表明屎肠球菌具有抗氧化作用[5]以及在代谢过程中能产生有机酸、细菌素等物质，对肠道中病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌等生长有抑制作用[6]，但是，以屎肠球菌发酵脱脂乳具有的抑菌、抗氧化活性研究不多。

目前，屎肠球菌主要应用在饲料、畜禽养殖业中，乳制品方面应用较少。通过探究从新疆酸奶疙瘩中分离出来的屎肠球菌在脱脂乳中的发酵特性，以及发酵乳具有的益生功能，为屎肠球菌的进一步研究和在乳制品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

屎肠球菌（Enterococcus faecium） 实验室保存菌种，分离自新疆酸奶疙瘩；保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌种（Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus，简称混合菌） 购于科汉森有限公司；大肠杆菌（Escherichia Coli）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肠链球菌（Intestinal Streptococcus） 实验室保存菌种；脱脂奶粉 新西兰进口；胰蛋白酶PTN6.0S（7.05×104U/g） 广州明远工贸有限公司；丁二酮、三氯乙酸、碘、碘化钾 均为分析纯。

AL104型电子分析天平 深圳市衡通伟业科技仪器有限公司；DL-5型低速大容量离心机 上海优浦科学仪器有限公司；UVmin-1240型分光光度计 岛津仪器有限公司；pHs-2F型pH计 上海精科；AHYQHH-1型恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；SNB-1型粘度计 上海方瑞仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 脱脂乳培养基：10g脱脂乳粉溶于100mL蒸馏水，配成复原乳后，115℃、灭菌15min。

营养肉汤（NB）培养基：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃、灭菌15min。

1.2.2 发酵乳的制备 屎肠球菌冻干菌粉在脱脂乳培养基活化后，以4%的接种量接入经95℃，5min灭菌的脱脂乳中，混匀至菌浓度106cfu/mL，37℃恒温培养，每隔3h取样测定相关指标。保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌以1∶1比例混合发酵脱脂乳作为对照。

1.2.3 屎肠球菌发酵脱脂乳指标测定 pH测定采用精密pH计；粘度测定采用SNB-1粘度计；滴定酸度测定参照《GB/T 13663-2008》；活菌数测定参照《GB/T 4789.35-2010》；乙醛含量参考文献[7]中方法测定；丁二酮含量参考文献[8]中方法测定；蛋白水解能力参考文献[9]中方法测定。

1.2.4 发酵乳抑菌测试 大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠链球菌为指示菌，指示菌用NB培养基活化，调整活菌数为107cfu/mL。屎肠球菌发酵乳4000r/min，离心10min，取上清液，冷冻浓缩为原来体积的四分之一，备用。用1mol/L的HCl或者NaOH，将发酵上清液调节pH为4、5、6、7、9、11，进行抑菌实验；发酵上清液在60、80、100℃温度下处理20min，进行抑菌实验；加入量为1mg/mL胰蛋白酶，调节pH为7，37℃水解1.5h，水解结束后pH调回6.5，以水解液进行抑菌。对照为发酵乳原液，采用牛津杯扩散法[10]进行测定。

1.2.5 发酵乳抗氧化能力测试 屎肠球菌发酵乳4000r/min，离心15min，去除活菌和大分子蛋白，取上清液及4℃冷藏12h上清液为样品。以VC作为对照。发酵乳上清液对羟自由基清除能力参考文献[11]中的方法进行测定；发酵乳上清液对超氧阴离子自由基清除能力参考文献[12]中的方法测定；发酵乳上清液总还原能力参考文献[13]中的方法进行。

2 结果与讨论

2.1 屎肠球菌发酵乳中酸度与pH的变化

滴定酸度反应了包括肽段和游离氨基酸残基在内的所有酸性基团的总和，pH反映游离氢离子浓度。其中乳酸是乳酸菌的主要代谢产物，是酸度上升的重要因素，它可以赋予发酵乳清爽的酸味。如图1、图2所示，屎肠球菌发酵脱脂乳，pH下降较快，滴定酸度增长较快。发酵9h后，酸度为85.35°T，高于传统发酵乳的75.11°T；pH为3.98，低于传统发酵乳的4.17；且pH最终可以达到3.45；酸度123.55°T。表明屎肠球菌具有较强的产酸性能和乳糖降解能力。

图1 不同菌株在发酵过程中pH变化Fig.1 Changes of pH of different strains in fermentation process

图2 不同菌株在发酵过程中滴定酸度变化Fig.2 Changes of titratable acidity of different strains in fermentation process

2.2 屎肠球菌发酵乳中活菌数与粘度的变化

屎肠球菌经脱脂乳活化后，在脱脂乳中增长速度很快，18h后进入了稳定期，活菌数达到峰值1.10× 1010cfu/mL，18h后，活菌数略有下降（见图3）。

图3 不同菌株在发酵过程中活菌数变化Fig.3 Changes of viable cell counts of different strains in fermentation process

屎肠球菌发酵过程中，随着发酵时间延长，粘度呈现先上升后下降的趋势（见图4）。粘度反映发酵乳形成凝乳的过程，酪蛋白颗粒间的静电作用导致粘度的上升，脱脂乳中缺少脂肪，凝乳时组织状态较松散，并未明显出现粘度的突增点，随后的发酵过程中，粘度进一步升高，发酵15h，粘度值为929mPa·s显著低于传统酸奶6h时1734.13mPa·s。可能与对数期菌代谢产生的胞外多糖有关，胞外多糖可以使发酵乳具有良好的拉丝性或比较黏稠的质地[14]。发酵后期，由于有部分乳清析出，粘度下降。

图4 不同菌株在发酵过程中粘度变化Fig.4 Changes of viscosity of different strains in fermentation process

2.3 屎肠球菌发酵乳中丁二酮与乙醛的变化

丁二酮是酮香型发酵乳的主要风味物质，通过柠檬酸代谢途径产生，α-乙酰乳酸被氧化形成丁二酮，乙醛由乳酸菌发酵过程中产生的氨基酸、核酸及丙酮酸代谢产生[15]，是发酵乳的基本风味物质。屎肠球菌发酵过程中丁二酮含量先上升后趋于稳定，发酵6h，丁二酮含量为3.07μg/mL，与传统混合菌产量3.96μg/mL相当，发酵18h达12.08μg/mL。发酵初期，大部分柠檬酸用于进行三羧酸循环，丁二酮的积累较慢。继续发酵，丁二酮含量快速上升，与丁二酮形成的最适pH4.3～4.8相关。发酵后期，由于菌种代谢活力较低和丁二酮的集聚，丁二酮含量保持在相对高且稳定的状态（图5）。

图5 不同菌株发酵过程中丁二酮含量变化Fig.5 Changes of diacetyl of different strains in fermentation process

图6 不同菌株发酵过程中乙醛含量变化Fig.6 Changes of acetaldehyde of different strains in fermentation process

在发酵过程中，乙醛生成酶的活性大于乙醇转化酶时，乙醛才能积累。如图6所示，屎肠球菌发酵过程中，乙醛含量总体趋势是随时间延长而增长的。发酵6h，乙醛含量为16.74μg/mL，高于传统混合菌12.28μg/mL。在12～18h间，随着时间延长呈直线增长的趋势（p＜0.05），在24h含量高达90.12μg/mL，远高于文献报道，在单一乳酸菌发酵的发酵乳中，主要羰基化合物乙醛含量2.0～41.0μg/mL[16]，表明屎肠球菌具有强的产香特性。

2.4 屎肠球菌的蛋白水解活力变化

屎肠球菌在繁殖过程中分泌蛋白酶和肽酶，可以降解酪蛋白和肽，产生丰富的小分子肽和氨基酸，适度的蛋白水解对改善制品风味以及生成活性多肽，具有重要作用。由图7可知，游离氨基酸的含量总体呈现曲折增长的趋势（p＜0.05）。发酵24h，含量为331.92μg/mL，远高于传统混合菌产生量192.4μg/mL。与吕加平[17]研究相比，同样的测定方法，产生的游离氨基酸，瑞士乳杆菌为439.54μg/mL，干酪乳杆菌为85.51μg/mL。屎肠球菌具有良好的蛋白水解能力，感官评定无异常风味产生。

图7 不同菌株在发酵过程中游离氨基酸变化Fig.7 Changes of free amino acids of different strains in fermentation process

2.5 屎肠球菌发酵乳抑菌特性研究

屎肠球菌发酵乳原液对常见致病菌均有抑制作用（结果见表1）。酸性条件下，发酵上清液的抑菌效果较好，碱性条件下抑菌能力消失，抑菌物质可能是乳酸，或是在酸性条件下起作用的某些物质。发酵上清液经过100℃、20min热处理后，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌仍有抑制作用，表明抑菌物质具有一定的热稳定性。经胰蛋白酶处理后，发酵上清液液对大肠杆菌、肠链球菌均无抑制作用，对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌能力减弱，说明抑菌物质对蛋白酶具有敏感性。该结论与Simova[10]，Rehaiem等[18]的研究结果相似，从乳制品中分离的屎肠球菌在发酵过程中产生的细菌素，能耐受pH2～10，具有热稳定性及对蛋白酶的敏感性。

2.6 屎肠球菌发酵乳抗氧化指标的测定

人体内代谢产生的自由基与衰老、癌症、动脉硬化等疾病有关，羟自由基是目前所有活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，O2-·的形成是氧毒性的主要因素[19]，可以引起膜损伤，外源性抗氧化剂可以帮助人体维持体内自由基平衡。

表1 发酵乳上清液抑菌结果（n=4）Table 1 The antibacterial properties of fermented milk supernatant（n=4）

表2 发酵乳上清液抗氧化结果（n=3）Table 2 The results of antioxidant activities of fermented milk supernatant（n=3）

结果见表2，屎肠球菌发酵乳具备一定的抗氧化能力，常温下羟自由基清除率达96.84%，冷藏12h，抗氧化能力略有下降，但仍远高于对照组0.2mg/mL VC的清除率；超氧阴离子清除能力和总还原能力显著低于对照组VC。抗氧化机理现在没有统一定论，但蛋白水解过程中产生的抗氧化肽对抗氧化活性有积极作用[20]，发酵乳抗氧化功能对增强乳酸菌抵抗含氧化合物的毒性，帮助乳酸菌群在肠道微生物生态系统中自我防御有重大意义。

3 结论

屎肠球菌发酵脱脂乳相比对照组保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合菌具有更好的产酸、产香能力、蛋白水解能力等发酵特性。屎肠球菌在脱脂乳中经过37℃发酵24h时，滴定酸度为123.55°T，丁二酮含量为12.31μg/mL，乙醛含量高达90.12μg/mL，均显著升高，并且产生游离氨基酸含量为331.92μg/mL，远高于混合菌产生量192.4μg/mL。而且，屎肠球菌发酵乳香味纯正，有屎肠球菌产生的特殊风味。

屎肠球菌发酵乳上清液具备一定的羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力与还原能力，显示了抗氧化活性。发酵乳对大肠杆菌、沙门氏菌、肠链球菌、金黄色葡萄球均有抑制效果，且抑菌物质经过不同温度、pH、酶处理后，对沙门氏菌与金黄色葡萄球菌仍有良好抑制作用。

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Study on the fermentation and function characteristics of Enterococcus Faecium

XIA Yu，ZHENG Hua，LIN Jie*，XU Guo-bo
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The potential application in dairy products of Enterococcus faecium selected from Xinjiang yogurt bumps was discussed.The fermentation characteristics of Enterococcus faecium in the skin milk and the antioxidative and antibacterial activity of fermentation liquid were studied via the determination on titration acidity，diacetyl，acetaldehyde，free amino and so on.The results showed that Enterococcus faecium demonstrated strong acid production，aroma-producing and proteolytic activity，the titration acidity was 123.55°T，the characteristic flavor contained 12.31μg/mL of diacetyl，90.12μg/mL of acetaldehyde，the free amino acids content was 331.92μg/mL and the living cells was up to 1.10×1010cfu/mL after incubation for 24 hours at 37℃.Fermented liquid showed inhibitory activity against pathogenic microorganisms and antimicrobial substances were resistant to heating，stable at a wide pH range，sensitive to protease.The scavenging activity on hydroxyl radical and superoxide radical anion of fermented milk were 96.84%，31.33%.

Enterococcus faecium；fermentation characteristics；inhibitory activity；antioxidant

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0123-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.017

2013－09－16 *通讯联系人

夏玉（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品加工、保藏与包装。

广东省科技攻关项目（2012B010300019）。