大鼠胚胎神经干细胞体外培养及诱导分化

王 楠，李晓凡，庄春雨，徐 尧，菅若蕾，张同存

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

大鼠胚胎神经干细胞体外培养及诱导分化

王 楠，李晓凡，庄春雨，徐 尧，菅若蕾，张同存

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

神经干细胞在理论研究和临床应用上有着广泛的前景．本文主要在体外分离培养SD大鼠胚胎前脑的神经干细胞，并分别用去除生长因子或添加全反式维甲酸(ATRA)两种方法诱导分化．免疫荧光染色技术分别检测细胞巢蛋白(Nestin)的表达及分化后β微管蛋白Ⅲ(β-Ⅲtubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达，计算分化率．结果显示：细胞生长状态良好，呈Nestin表达阳性．分化后可获得β-Ⅲtubulin及GFAP表达阳性的细胞，其中ATRA诱导方法获得β-Ⅲtubulin阳性细胞较多．

神经干细胞；SD大鼠胚胎；扩增；分化

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)存在于哺乳动物胚胎及成体的中枢神经系统，具有自我增殖和多潜能分化能力，在一定条件下，可以分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞．1992年Spiliotopoulos 等[1]从成年小鼠纹状体分离得到能在体外不断增殖且具有多种分化潜能的细胞群，表明在成熟的神经系统中存在神经干细胞．当神经系统受到各种伤害时，神经干细胞能被诱导分化为某种神经元来替代损伤的神经细胞，达到重建结构和恢复功能的目的[1-2]．因此，神经干细胞为中枢神经系统损伤、神经退行性疾病等的细胞移植替代治疗以及基因治疗提供了一条新的思路与途径[1-3]，在理论研究和临床应用上有着广泛的前景，是当今生命科学领域研究的热点；但要将神经干细胞应用于临床实践还有许多问题尚待解决．由于成年动物体内不能直接获得足够的神经干细胞，因此体外建立分离、培养和鉴定神经干细胞及定向诱导分化为特定神经元的方法就成为研究和应用神经干细胞最基础而关键的工作．本文目的在于分离培养Sprague Dawley(SD)大鼠胚胎神经干细胞，改进培养条件，大量扩增，同时在体外利用去除生长因子或加入全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)两种方法进行诱导分化，比较两种诱导分化获得神经元与神经胶质细胞情况，希望为进一步的研究和使用NSCs奠定理论和实验基础．

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

怀孕14～16d健康SD大鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物许可证号为SCXK–(军)2012–0004，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准．

1.1.2主要试剂

DMEM/F12培养基、B27无血清培养基添加因子，Gibco公司；碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)，Peprotech公司；Accutase®solution细胞分散液，Sigma公司；多聚赖氨酸，EMS公司；巢蛋白(Nestin)多克隆抗体，博奥森公司；β微管蛋白Ⅲ(β-Ⅲtubulin)多克隆抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体，Abcam公司；FITC标记山羊抗兔IgG、TRITC标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司．

1.2方法

1.2.1神经干细胞的分离和原代培养

将SD大鼠孕鼠(孕龄14～16d)引颈处死，无菌条件下取出子宫，用无菌PBS冲洗后分离胚胎的前脑组织，仔细去除血管和脑膜，用眼科剪将前脑组织剪成1mm3左右的碎块，将其放入含有4℃预冷的DMEM/F12基础培养基的离心管中，用Pasteur吸管反复吹打20～30次；静置5min后在沉淀的组织块中以1∶1的比例加入Accutase®solution细胞分散液和DMEM/F12基础培养基，反复吹打后置于37℃培养箱中消化10min，向离心管中加入2mL含FBS胎牛血清的培养基终止反应，取上清液200目滤网过滤，1,000r/min离心5min，弃上清液，加入含有20,ng/mL EGF、10,ng/mL bFGF和2%B27的DMEMF12培养基(完全培养基)重悬细胞，经苔盼蓝染色，调整细胞密度为1×105mL–1，接种至100mm培养皿中，置于37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中静置培养．每3d半量换液1次．

1.2.2神经干细胞的传代培养

神经干细胞原代培养7～10d后，收集形成的细胞球1,000r/min离心5min，弃上清液，利用Accutase®solution细胞分散液消化细胞，进行传代培养．

1.2.3神经干细胞免疫荧光鉴定

收集培养至第3代的神经干细胞，接种于多聚赖氨酸包被的24孔细胞培养板中，37℃培养24h后，常规方法进行免疫荧光检测．首先4%多聚甲醛室温固定30min；PBS清洗细胞后加入0.25%的透膜剂Triton-100(PBS稀释)处理细胞40min；5%正常山羊血清封闭液封闭1h；去除血清，滴加一抗(兔抗鼠Nestin抗体)，37℃孵育2h；PBS清洗后加入相应的二抗(TRITC标记的山羊抗兔IgG)，同时用DAPI染核，室温避光孵育90min；PBS清洗后激光扫描共聚焦显微镜(Olympus公司)下观察并照相．

1.2.4神经干细胞的诱导分化

收集培养至第3代的神经干细胞，PBS洗涤3次，离心后重悬细胞，Pasteur吸管轻轻吹打进行机械分离，使其分散成较小细胞团，以1×104mL–1细胞密度接种于24孔细胞培养板中(孔板预先用多聚赖氨酸处理)，分别用去因子和添加ATRA两种方法进行诱导培养．去因子诱导组：加入含2% B27神经诱导培养基DMEM/F12；ATRA诱导组：加入完全培养基并添加3µmol/L ATRA．置于37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中静置培养．每3d半量换液1次，逐日观察并记录细胞形态．

1.2.5免疫荧光染色鉴定分化后的细胞

将诱导分化12d的细胞进行免疫荧光染色，使用一抗为兔抗鼠β-Ⅲtubulin、GFAP抗体，使用相应的二抗为TRITC和FITC标记的山羊抗兔IgG，同时加入DAPI染细胞核，激光扫描共聚焦显微镜下观察并照相．随机取20个视野，以DAPI染色的细胞核数为总细胞数，分别计数β-Ⅲtubulin和GFAP阳性细胞数，计算神经元、神经胶质细胞的分化率．

1.2.6统计学分析

所有实验数据均用SPSS 13.0统计软件计算，实验数据均以±s表示.

2 结果与分析

2.1神经干细胞原代分离培养与传代培养

刚刚提取出的神经干细胞接种到培养皿中只有少量细胞集落以及大量的组织碎块等．细胞培养1～2d，部分细胞开始聚集并悬浮生长，不能增殖的细胞以及单个的死亡的神经干细胞沉到培养皿底部(图1(a))．细胞培养3～5d，细胞逐渐增殖成大小不一、形状不规则的细胞团(图1(b))．细胞培养6～7d，细胞集落逐渐形成由几十至几百细胞组成的细胞球，边缘发亮，遮光性强(图1(c))．传代培养主要利用Accutase®solution细胞分散液进行，传代后的细胞球生长更为迅速，培养液中的杂细胞几乎去除，培养背景逐渐清亮，细胞球直径更大，细胞球形状更加规则．

2.2神经干细胞的鉴定

对传代至3代的神经干细胞进行鉴定，观察神经巢蛋白的染色情况，结果见图2．结果显示，传代后的神经干细胞Nestin的检测结果呈阳性．这说明从孕14d SD大鼠胚胎的前脑中分离获得的细胞为神经干细胞，表达神经干细胞的特异性标志Nestin，并且多次传代后仍具有很好的干性．

图1　神经干细胞体外扩增培养的形态Fig. 1 Morphological pictures of neurospheres isolated from rat embryos

图2　Nestin免疫荧光鉴定神经干细胞Fig. 2 Immunofluorescent staining for Nestin in neural stem cells

2.3神经干细胞的诱导分化及鉴定

收集培养至第3代的神经干细胞，利用去除EGF和bFGF两种生长因子方法诱导分化，结果如图3所示．

图3　分化的神经干细胞的形态图Fig. 3 Morphological pictures of differentiated NSCs

诱导1～3d，少量细胞从细胞球边缘分离出来，呈贴壁生长形态(图3(a))；4～7d，细胞球边缘贴壁细胞逐渐增多，呈放射状分布，贴壁生长的细胞开始有丝状物质出现(图3(b))；8～12d，绝大多数细胞游走出来，细胞球失去形态，细胞分散为单细胞层，细胞突起继续增多变长，细胞与细胞之间交互形成网状，并且伴有神经丝出现(图3(c))．

添加ATRA诱导1～3d，有少量细胞分离出来，贴壁生长，并且伴有少量神经丝出现(图3(d))；4～7d，更多细胞分离出来贴壁生长，更多神经丝出现，细胞球体积缩小(图3(e))；8～12d，几乎所有细胞分离出来贴壁生长，分离出的细胞与细胞之间交互形成网状，有大量的神经丝生成(图3(f))．

经去除生长因子EGF和bFGF(图4(a)—图4(d))以及添加ATRA(图5(a)—图5(d))这两种诱导方法诱导分化12d，取细胞进行β-Ⅲtubulin和GFAP的免疫荧光染色．免疫荧光结果显示，经两种诱导方法诱导后，神经球中细胞可以分化为神经元、神经胶质细胞，表达神经元的特异性标志物β-Ⅲtubulin和神经胶质细胞的特异性标志物GFAP．这进一步证实了从SD大鼠胚胎中分离得到的细胞具有向神经元和神经胶质细胞分化的能力．

图4　免疫荧光鉴定去除生长因子诱导12d的GFAP和β-Ⅲtubulin阳性细胞Fig. 4 Immunofluorescent staining identified GFAP and β-Ⅲtubulin positive cells 12days after removing the growing factors

图5　免疫荧光鉴定添加ATRA诱导12d的GFAP和β-Ⅲtubulin阳性细胞Fig. 5 Immunofluorescent staining identified GFAP and β-Ⅲtubulin positive cells 12 days after adding ATRA

将两种诱导结果进行比较，结果如图6所示．发现去除生长因子EGF和bFGF组中，神经胶质细胞标志物GFAP阳性细胞占(58.70±2.14)%；神经元细胞标志β-Ⅲtubulin阳性细胞占(37.47±3.37)%．在添加ATRA诱导组中，(52.80±5.70)%细胞呈现GFAP阳性；(41.59±4.79)%细胞呈现β-Ⅲtubulin阳性．因此，与去除生长因子相比，在添加ATRA诱导神经干细胞分化过程中，神经元细胞数较多．

图6　GFAP和β-Ⅲtubulin阳性细胞数的分化率Fig. 6 Percentage of GFAP and β-Ⅲtubulin positive cells

3 讨 论

神经干细胞在发育过程中其自我更新、增殖和分化的调控机制非常复杂，受很多因素影响．体外培养的神经干细胞主要与其所在的微环境密切相关．本实验采用无血清培养基，加入能够刺激神经干细胞生长的3种因子bFGF、EGF和B27，对神经干细胞进行体外的增殖培养．EGF主要作用是促进神经干细胞的长期存活；而bFGF则可能对于神经干细胞向神经元和部分程度向胶质细胞分化起到一定的作用；B27添加剂含有多种促进干细胞生长和存活的微量元素．本实验培养的细胞球呈悬浮生长，细胞圆润饱满，活力状态好，经过多次连续传代，仍可形成神经球，表现出良好的持续增殖能力．

目前常用的分离方法有酶解法[1,4]和机械吹打法[3,5]，若使用机械吹打法需要掌握吹打的时间、力度和次数等条件，而用酶解法操作简单、方便，但需要掌握酶解的时间．因此，本实验采用酶解法与机械吹打法相结合的方法，可以避免机械吹打法以及酶解法过度导致的细胞损伤的缺点，较好地对NSCs进行分离及传代培养．传代后的细胞生长状况良好，从细胞形态上观察与原代细胞相同，经免疫荧光染色巢蛋白表达呈阳性．巢蛋白(Nestin)是一种中间丝蛋白，又称为细胞骨架蛋白，该蛋白只在多潜能的神经外胚层细胞表达，仅在胚胎早期神经上皮表达，目前是公认的神经干细胞的标志物．

ATRA通过维甲酸受体RARs对神经细胞的发育、分化产生重要的影响，能够上调某些神经营养因子如脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor，BDNF)受体的表达而促进神经干细胞的发育．Schuldiner等[6]研究表明，ATRA具有诱导ES细胞向神经胶质细胞分化或可使ES细胞分化为有功能的神经元．Rasmussen等[7]发现，利用ATRA与神经生长因子BDNF协同作用能够使神经始祖细胞诱导成为神经元．Takahashi等[8]证明了ATRA可以与神经生长因子协同作用使人的神经干细胞分化为神经元．Bain等[9]证实了ATRA能诱导ES细胞分化为神经元样细胞．另外，有很多研究证实去除EGF和bFGF两种生长因子可以诱导神经干细胞成为神经元．Deierborg等[10]构建大鼠的脑缺血模型，并将得到的神经干细胞利用去因子的方式诱导分化为神经元和神经胶质细胞．但也有报道[11]认为，bFGF在神经干细胞的存活、增殖和分化上有着促进作用．

综上所述，本实验分离培养的神经干细胞可稳定增殖、长期传代．在去除生长因子或加入ATRA的条件下可诱导神经干细胞分化为成熟的神经元和神经胶质细胞，说明从SD大鼠前脑中分离获得的神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能．并且，加入ATRA可以大大提高向神经元细胞分化的比例，为高效诱导神经干细胞定向分化研究提供新思路．神经干细胞的成功分离和体外培养对通过细胞移植治疗中枢神经系统疾病具有重要意义．

［1］ Spiliotopoulos D，Goffredo D，Conti L，et al. An optimized experimental strategy for efficient conversion of embryonic stem(ES) derived mouse neural stem (NS) cells into a nearly homogeneous mature neuronal population[J]. Neurobiology of Disease，2009，34(2)：320-331.

［2］ 白瑞樱，张紫娟，王亚莉，等. 乳鼠海马神经干细胞的体外分离、扩增和分化研究[J]. 中国细胞生物学学报，2012，34(10)：1017-1022.

［3］ Vescovi A L，Snyder E Y. Establishment and properties of neural stem cell clones：Plasticity in vitro and in vivo[J]. Brain Pathology，1999，9(3)：569-598.

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［5］ An Y H，Wang H Y，Gao Z X，et al. Differentiation of rat neural stem cells and its relationship with environment[J]. Biomedical and Environmental Sciences，2004，17(1)：1-7.

［6］ Schuldiner M，Eiges R，Eden A，et al. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells[J]. Brain Research，2001，913(2)：201-205.

［7］ Rasmussen M A，Hall V J，Carter T F，et al. Directed differentiation of porcine epiblast-derived neural progenitor cells into neurons and glia[J]. Stem Cell Research，2011，7(2)：124-136.

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［10］ Deierborg T，Roybon L，Inacio A R，et al. Brain injury activates microglia that induce neural stem cell proliferation ex vivo and promote differentiation of neurospherederived cells into neurons and oligodendrocytes[J]. Neuroscience，2010，171(4)：1386-1396.

［11］ 张文治，苏心，秦进喜，等. EGF和FGF-2促神经干细胞增殖与分化研究[J]. 现代神经疾病杂志，2002，2(6)：354-359.

责任编辑：郎婧

Culture and Differentiation of Rat Embryonic Neural Stem Cells in Vitro

WANG Nan，LI Xiaofan，ZHUANG Chunyu，XU Yao，JIAN Ruolei，ZHANG Tongcun

(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Neural stem cells(NSCs)have great potential in basic research and clinical application. In this study，NSCs were isolated from the forebrain of SD rat embryos，cultured in vitro，and then induced to differentiate by removing the growing factors or adding all-trans retinoic acid(ATRA). Immunofluorescence technology was used to test the expression of Nestin and differentiation marker β-Ⅲtubulin and GFAP，and then the percentage of differentiated cells were calculated. The results show that the isolated cells can be amplified in vitro and exhibit Nestin positive expression. The differentiated cells expressed β-Ⅲtubulin and GFAP. Compared with growing factor withdrawal，addition of ATRA resulted in more β-Ⅲtubulin positive cells.

neural stem cells；SD rat embryo；proliferation；differentiation

Q28

A

1672-6510(2014)04-0001-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.001

2013–11–27；

2014–01–08

国家自然科学基金资助项目(31171303)；教育部科技研究重点项目(212010)

王 楠（1979—），女，吉林人，教授；通信作者：张同存，教授，tony@tust.edu.cn.