双水相萃取分离苹果皮中果胶酶的研究

翁 霞，姜显光

（鞍山师范学院化学与生命科学学院，辽宁鞍山114007）

双水相萃取分离苹果皮中果胶酶的研究

翁 霞，姜显光

（鞍山师范学院化学与生命科学学院，辽宁鞍山114007）

以苹果皮作为提取果胶酶的原材料，采用PEG/Na2HPO4双水相系统对果胶酶进行萃取分离，研究了PEG1000浓度、Na2HPO4浓度、pH、NaCl浓度等因素对果胶酶分配系数的影响。结果表明：双水相体系质量组成为PEG1000 26%、Na2HPO417%、NaCl 0.004%，pH为4.0时，果胶酶的萃取效率较好，实验中分配系数最高可达为13.8954。

双水相，果胶酶，苹果皮，酶活力

果胶酶（pectinases）是世界四大酶制剂之一，通常所说的果胶酶是指分解果胶的多种酶的总称，在食品加工、饲料加工、造纸、环境保护、废水处理、诱导植物抗病等方面都有很大的应用价值[1]。目前，双水相萃取果皮中的果胶酶还没有报道，报道较多的是PEG和（NH4）2SO4双水相萃取体系萃取分离果胶酶[2-4]及果胶酶活力测定中酶活力与稀释倍数的关系[5]，我国果胶酶的生产技术很不成熟，提取分离中效率低、酶易失活是要重点解决的问题之一。因此，本研究对双水相技术提取果胶酶进行了初探，以PEG/Na2HPO4双水相体系为考察对象，比较了不同浓度的PEG1000和Na2HPO4组成的双水相体系对果胶酶的萃取效果，并考察了影响萃取效果的各种因素。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果 市售；柠檬酸 分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）、聚乙二醇1000（化学纯）、考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白（生物纯）、葡萄糖（分析纯）、维生素C（分析纯）3，5-二硝基水杨酸（化学纯） 国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠 分析纯，沈阳化学试剂厂；亚硫酸钠（分析纯）、酒石酸钾钠（优级纯） 天津市光复精细化工研究所。

TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PL2002型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；80-2B型离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-4型恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果胶酶粗滤液的制备 称取10g切碎的市售苹果皮，按1∶1料液比加入pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液后再加入1mL 0.025%维生素C，于研钵中捣碎，在离心机中1200r/min离心10min，于漏斗中过滤，得滤液备用。

1.2.2 PEG/Na2HPO4双水相体系的建立 取大试管一只，称重（W0）。准确称量一定重量的40%PEG1000溶液，加入试管中，计算出加入的PEG1000的量（g）。逐渐加入30%Na2HPO4溶液，混合，直至试管出现浑浊。称重（W1），计算加入的Na2HPO4（g）。逐滴再加入蒸馏水，振荡，浑浊的两相系统“刚刚变澄清”，称重，计算出系统总质量（W1-W0）。计算系统中PEG1000和Na2HPO4的质量浓度。

1.2.3 双水相萃取操作方法 参照上述的成相条件，在离心刻度试管中分别加入1mL一定浓度的PEG1000、1mL一定浓度的NaH2PO4、1mL缓冲液、1mL果胶酶粗滤液，再加入蒸馏水使体系达到10g。混匀后4000r/min离心10min分离使其分相，分相后测出上下相酶活、蛋白含量，计算比活力、分配系数K。

1.2.4 牛血清蛋白标准曲线的制作 取牛血清蛋白0.010g溶于适量蒸馏水中，用蒸馏水定容至100mL容量瓶，分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别加入0.8、0.6、0.4、0.2、0mL蒸馏水。牛血清蛋白的含量分别为20、40、60、80、100μg，依次加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合。用1cm比色皿，以用1.0mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝G-250溶液做参比溶液，根据分光光度法快速测定蛋白质的最大吸收波长为640nm，分别测量各溶液的吸光度值，绘制出标准曲线。

1.2.5 蛋白质含量测定方法 采用考马斯亮蓝法[6]。

式中：m2—从标准曲线查得的蛋白质的质量，μg；V—样品提取液总体积，mL；Vs—测定时所取样品提取液体积，mL；m—样品质量，g。

1.2.6 葡萄糖标准曲线的制作 取葡萄糖0.1g溶于适量蒸馏水中，用蒸馏水定容至100mL容量瓶，取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别加入1.8、1.6、1.4、1.2、1.0mL蒸馏水。葡萄糖的含量分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg，依次加入1.5mL DNS溶液，定容在25mL刻度试管中，摇匀，在沸水浴中加热5min，迅速冷却。用1cm比色皿，以用2.0mL蒸馏水加1.5mL DNS溶液做参比溶液，根据分光光度法快速测定葡萄糖的最大吸收波长为490nm，分别测量各溶液的吸光度值，绘制出标准曲线。

1.2.7 果胶酶酶活力测定 采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法[7]。取1mL缓冲液、0.5mL 10g/L葡萄糖溶液，加入0.5mL苹果皮果胶酶提取液，混匀后在50℃水浴中保温1h，保温后迅速加入1.5mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5min。然后迅速冷却至室温，用蒸馏水稀释至25mL刻度处，混匀，在波长490nm处测吸光度；依还原糖葡萄糖绘制标准曲线，计算果胶酶酶活性。

式中：m1—从标准曲线查得的葡萄糖质量，mg；V—样品提取液总体积，mL；Vs—测定时所取样品提取液体积，mL；t—酶促反应时间，t；m—样品质量，g；1.08—葡萄糖换算成半乳糖醛酸的系数（=194/180）。

1.2.8 比活力的测定 根据酶活力测定和蛋白含量测定结果计算果胶酶比活力：

1.3 双水相萃取分离苹果皮中果胶酶的单因素实验

1.3.1 PEG1000浓度对果胶酶分配系数的影响 取10g苹果皮加入10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和1mL 0.025%维生素C（pH=5），捣碎研磨4000r/min离心10min后经4层纱布过滤得滤液。在Na2HPO4浓度为19%时，分别以PEG1000浓度为24%、25%、26%、27%、28%构成双水相萃取苹果皮粗提液中的果胶酶。测定果胶酶的比活力并计算果胶酶的分配系数K。

式中：比活力上—上相提取液中果胶酶的比活力；比活力下—下相提取液中果胶酶的比活力。

1.3.2 Na2HPO4浓度对果胶酶分配系数的影响 取10g苹果皮加入10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和1mL 0.025%维生素C（pH=5），捣碎研磨离心后经4层纱布过滤得滤液。按1.3.1确定的最佳PEG1000萃取浓度，分别以Na2HPO4浓度为15%、16%、17%、18%、 19%构成双水相萃取苹果皮粗提液中的果胶酶。测定果胶酶的比活力并计算果胶酶的分配系数K。

1.3.3 pH浓度对果胶酶分配系数的影响 取10g苹果皮加入10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和1mL 0.025%维生素C（pH=5），捣碎研磨离心后经4层纱布过滤得滤液。按1.3.1确定的最佳PEG1000萃取质量浓度，1.3.2确定的最佳磷酸氢二钠萃取质量分数，分别以pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0构成双水相萃取苹果皮粗提液中的果胶酶。测定果胶酶的比活力并计算果胶酶的分配系数K。

1.3.4 NaCl浓度对果胶酶分配系数的影响 取10g苹果皮加入10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和1mL 0.025%维生素C（pH=5），捣碎研磨离心后经4层纱布过滤得滤液。按1.3.1确定的最佳PEG1000萃取质量浓度，1.3.2确定的最佳磷酸氢二钠萃取质量浓度，1.3.3确定的最佳的pH，分别以NaCl浓度为0.0005%、0.0010%、0.0020%、0.0040%、0.0060%构成双水相萃取苹果皮粗提液中的果胶酶。测定果胶酶的比活力并计算果胶酶的分配系数K。

1.4 正交实验

根据单因素实验结果，选取PEG1000浓度、Na2HPO4浓度、pH、NaCl浓度四个因素，采用正交实验表进行实验。正交因素水平见表1。

表1 正交因素水平表Table.1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 结果与分析

2.1 牛血清蛋白标准曲线制作

图1 牛血清蛋白标准曲线Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

由图1可知，牛血清蛋白标准曲线的线性方程为：y=0.0059x-0.0104，相关系数R2=0.9949。

2.2 葡萄糖标准曲线制作

由图2可知，葡萄糖标准曲线的线性方程为：y= 0.9637x+0.01026，相关系数R2=0.9901。

图2 葡萄糖浓度标准曲线Fig.2 The standard curve of dextrose density

2.3 PEG1000浓度对果胶酶分配系数的影响

表2 PEG1000浓度对果胶酶分配系数的影响Table.2 Effect of different concentration of PEG1000 on distribution coefficient of pectinase

由表2可知，随着PEG1000质量浓度的增加，果胶酶分配系数先增大后减小。在Na2HPO4浓度为19%，PEG1000质量浓度为26.0%时，分配系数最大。因此，确定PEG1000质量浓度为26.0%时为最佳提取浓度。

2.4 Na2HPO4浓度对果胶酶分配系数的影响

表3 Na2HPO4浓度对果胶酶分配系数的影响Table.3 Effect of different concentration of Na2HPO4on distribution coefficient of pectinase

由表3可知，随着Na2HPO4浓度的增加，果胶酶分配系数先增大后减小。在PEG1000质量浓度为26%，Na2HPO4浓度为17.0%时，分配系数最大，因此，确定Na2HPO4浓度为17.0%时为最佳提取浓度。

2.5 pH对果胶酶分配系数的影响

表4 pH对果胶酶分配系数的影响Table.4 Effect of different pH on distribution coefficient of pectinase

由表4可知，随着pH的增加，果胶酶分配系数先增大后减小。在PEG1000质量浓度为26.0%，Na2HPO4浓度为17.0%，pH为5.0时，分配系数最大，因此，确定pH为5.0时为最佳提取pH。

2.6 NaCl浓度对果胶酶分配系数的影响

表5 NaCl浓度对果胶酶分配系数的影响Table.5 Effect of different concentration of NaCl on distribution coefficient of pectinase

由表5可知，随着NaCl浓度的增加，果胶酶分配系数先增大后减小。在PEG1000质量浓度为26.0%，Na2HPO4浓度为17.0%，pH为5.0，NaCl浓度为0.002%时，分配系数最大，因此，确定NaCl浓度为0.002%时为最佳提取浓度。

表6 正交实验设计及数据处理Table.6 Designing of orthogonal test and data processing

表7 方差分析表Table.7 The variance analysis table

2.7 正交实验结果分析

由表6可知，各因素影响的主次顺序为：D＞C＞B＞A，最优组合为：A2B2C1D3。正交实验确定双水相萃取体系对苹果皮中果胶酶活力的影响最佳反应条件为：PEG1000质量浓度为26%，磷酸氢二钠质量浓度为17%，pH为4.0，氯化钠质量浓度为0.004%。最优组合A2B2C1D3并不在9个正交实验结果中，对该组合进行验证实验得，双水相萃取体系萃取苹果皮中果胶酶分配系数最大可达13.8954。高于表6中其他组合的分配系数。

由表7可知，D因素影响显著，A、B、C因素影响不显著，无显著性差异。即NaCl的添加量对PEG/Na2HPO4双水相系统分离果胶酶有显著影响，其余因素对实验影响不大。

3 结论

通过对影响果胶酶分配系数的双水相萃取体系PEG/Na2HPO4萃取效果的各因素进行考察得，PEG1000质量浓度为26%，磷酸氢二钠质量浓度为17%，pH为4.0，氯化钠质量浓度为0.004%时，果胶酶的分配系数最大，达13.8954。实验结果为果胶酶的萃取技术研究提供一定的理论依据。

[1]李祖明，张洪勋，白志辉，等.微生物果胶酶研究进展[J].生物技术通报，2010（3）：42-49.

[2]杨辉，张娟，王旭.PEG/（NH4）2SO4双水相体系萃取果胶酶[J].食品科学，2007，28（6）：124-127.

[3]王旭，周庆礼.PEG/（NH4）2SO4双水相萃取法提取果胶酶的研究[J].食品研究与开发，2007，28（9）：34-36.

[4]张娟，王博.聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取果胶酶的研究[J].陕西农业科学，2010（5）：95-97.

[5]张娟，王莹，王博.果胶酶活力与稀释倍数的测定与研究[J].陕西农业科学，2009（2）：54-56.

[6]王永华.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，2011：128.

[7]曾庆孝.果蔬采后生理生化实验指导[M].北京：化学工业出版社，2009：160-163.

Study on two-phase aqueous extraction of pectinase from apple peel

WENG Xia，JIANG Xian-guang
（College of Chemistry and Life Sciences，Anshan Normal University，Anshan 114007，China）

Pectin enzyme was extracted with the apple peel as raw material.The extraction of pectinase in twophase aqueous system was investigated.Effects of concentrations of polyethylene glycol 1000，the concentrations of Na2HPO4，pH，the concentrations of NaCl on the extraction coefficient K were studied.Results showed that the optimum conditions were as follows：the mass composition in two-phase aqueous system PEG1000 26%，Na2HPO417%，NaCl 0.004%，pH4.0，the highest extraction coefficient K obtained in experiments could reached 13.8954.

aqueous two-phase system；pectinase；apple peel；enzyme activity

TS201.1

B

1002-0306（2014）06-0265-04

2013－05－21

翁霞（1979-），女，硕士，讲师，研究方向：食品生物技术。

鞍山师范学院院级科研项目（11kyxm05）。